成體哺乳動物心肌細胞增殖及其調控

劉秀秀,周 斌

(中國科學院中國科學院生物化學與細胞生物學研究所中國科學院分子細胞科學卓越創新中心細胞生物學國家重點實驗室,上海200031)

心臟作為哺乳動物的肌肉泵,通過收縮向全身供血,在哺乳動物的一生中發揮著極其重要的作用.心血管疾病是目前造成死亡人數較多的幾種疾病之一,盡管現代醫學已經對這類疾病的治療有了很大的進步,但是更深層次的治療策略需要依靠對生理基礎更進一步的認識,其中心肌細胞的增殖一直是研究領域內的熱門話題.

1 成體心臟心肌細胞增殖

最初,普遍認為成體心臟中心肌作為一種終末分化徹底的細胞類型,基本不發生增殖[1-3],除非在發生損傷比如心肌梗死(myocardial infarction,MI)的情況下才會有增殖現象[3].由于心肌細胞普遍存在多核以及多倍體現象[2],單純的增殖分子標記的染色很難推測出潛在的待分裂細胞.所以如何檢測細胞的增殖一直是困擾領域內研究者的一大難題,直到2009年Bergmann等[4]巧妙地利用了同位素標記(14C)這一經典的生物學研究方法.該研究使用的方法學基礎是利用冷戰時核彈爆炸釋放到大氣中的14C,這些碳元素很快遍布全球并隨著摻入動植物而摻入人體,因此人體在某個時間段內產生的細胞的14C含量與當時大氣中的14C含量是一致的.由于碳元素有著漫長的半衰期,人體內細胞自產生到死亡,14C的含量是不變的,因此通過比對不同年份大氣的14C含量與不同細胞的14C含量就可以推測出該細胞的出生日期.已有研究得出人一生中約有50%的心肌細胞被替換為新的心肌細胞,而且越年輕的心肌細胞的更新速率越快——25歲時一年約更新1%,到了75歲一年約更新0.45%[4].后續的研究發現,人體內間質細胞和內皮細胞都以較高的年更新速率進行更新換代,只有心肌細胞基本處于低增殖的水平.但是3種細胞的更新換代水平都隨著年齡的增長而降低[5].另有獨立的研究認為,人心肌細胞在心肌梗死損傷后會出現增殖[6],而心肌細胞的平均壽命約8年,每年有13%左右的新心肌細胞生成[7].這些領域內的開辟性發現為后續的研究提供了方法學以及最終結果的指導.2012年,Steinhauser等[8]發展出利用穩定的同位素對細胞進行成像的多同位素成像質譜(multi-isotope imaging mass spectrometry,MIMS)技術,該技術可以在亞微米的分辨率下檢測穩定同位素的摻入,這為后續利用同位素摻入心肌細胞進行增殖研究提供了技術支持.利用15N的摻入,細胞內較自然水平的15N∶14N(0.37%)比值若有升高,則說明細胞發生了DNA的復制.以此為基礎計算出成體小鼠一年大概有4.4%的心肌細胞發生了DNA的復制[9].成體心臟中心肌細胞的多核以及多倍體現象使同位素摻入得到的結果可能僅僅是DNA復制而不是細胞周期的完成,但是檢測發現15N+的心肌細胞相較15N-的心肌細胞具有更高比例的二倍體心肌細胞,說明15N+的心肌細胞雖然不是全部但是部分完成了完整的細胞周期.大量的統計結果顯示15N+的心肌細胞中有約17%為二倍體,若發生DNA復制后還維持了二倍體的核型則認為母細胞發生了完全的細胞分裂,產生了一個新的心肌細胞,那么成體小鼠中一年大約有0.76%(4.4%×17%)的新的心肌細胞產生.

Bergmann等[4-5]和Senyo等[9]利用同位素摻入,以研究DNA復制的方法研究人與小鼠這兩種代表性哺乳動物成體后心肌細胞的增殖情況,為心肌細胞增殖領域的研究奠定了堅實的基礎.但是心肌細胞的多核和多倍體現象使得檢測到的信號存在一定的欺騙性,仍然有更進一步的工作需要完成.

除了同位素摻入的研究方法,過去的十幾年也見證了其他研究心肌細胞增殖方法的發展.早在2005年,Liqun Luo實驗室[10]就發展出了一種利用染色體間的同源重組來標記細胞的策略——mosaic analysis with double markers(MADM).在MADM小鼠的兩條染色體上,每條染色體包含一個被loxp位點隔斷的綠色熒光蛋白(green f l uorescent protein,GFP)的部分編碼區和紅色熒光蛋白(red f l uorescent protein,RFP)的部分編碼區,另一條染色體上則包含被loxp隔斷的兩種熒光蛋白的剩余編碼區,編碼區均按照N端到C端的順序排列.這一基于Cre同源重組酶識別loxp位點進行同源重組的遺傳工具小鼠,在細胞周期的G2期細胞內存在同源重組酶Cre的情況下,由于細胞內的兩條染色單體在一定概率下會發生染色體間的同源重組,使得同種熒光蛋白的編碼序列重組到一條染色體上.在后續M期的染色體分配中,有一定概率重組后的僅包含單個熒光蛋白編碼基因的染色體被分配到兩個細胞中,這樣分裂過后的兩個子代細胞分別被標記了綠色或者紅色熒光蛋白.也有一定概率僅包含單個熒光蛋白編碼基因的染色體被分到了同一個細胞中,那么細胞就同時表達綠色和紅色熒光蛋白.值得注意的是,如果細胞周期沒有完成而僅發生了DNA復制甚至細胞未發生DNA復制,則細胞都有一定概率發生同源重組,細胞也會同時表達綠色和紅色熒光蛋白,這在細胞分裂研究中是一個干擾的結果.因此Ali等[11]利用這一系統研究心肌細胞增殖時,僅研究細胞中帶有單色熒光的實驗結果,發現新生的小鼠確實會出現單色的心肌細胞,但是大部分的心肌細胞是雙色標記的,并且單色標記的心肌細胞并不會出現數目較多的細胞克隆.這都表明即使在新生期,心肌細胞也僅僅具有有限的增殖能力.在成體心臟中,正常生理條件以及左前降支結扎的條件下,4周之內心肌細胞基本不會出現單色標記.但這并不能說明成體心肌細胞不再增殖,因為MADM系統存在較低的重組效率,可能會損失確實發生了心肌細胞增殖產生的單色重組信號.2018年,同一實驗室的Sereti等[12]利用Rainbow報告基因系統進行克隆分析,在胚胎9.5、胚胎12.5、出生后當天進行標記,在后續的不同時間點收樣顯示心肌細胞所形成的每個克隆隨標記時間的后移,所包含的細胞數目變少,說明從胚胎期開始隨著小鼠慢慢長大,心肌細胞的增殖能力在逐漸減弱.這些小鼠早期的實驗結果均提示在成體期小鼠心肌細胞增殖的極低概率,與之前同位素摻入得到的結論并不矛盾.

Reza實驗室上述實驗結果的取得,得益于復雜的報告基因系統.是否可以利用增殖的標志蛋白驅動重組酶表達來標記細胞進行譜系示蹤？Hans Clevers實驗室對此問題進行了嘗試[13-15].該實驗室挑選了在細胞周期G1,S,G2,M期均存在表達的Ki67分子作為后續追蹤增殖信號的分子標記,并在小腸這一增殖比較旺盛的組織中檢測發現,Ki67直接驅動報告基因(RFP)表達可以檢測到增殖信號.為了進行進一步的譜系示蹤,Ki67IRES-CreERT2基因敲入小鼠應運而生,Basak等[14]首先在神經干細胞領域研究了活躍神經干細胞在穩態和損傷情況下的增殖.近期研究表明,成體心臟中幾乎不具備可以轉變成心肌細胞的心臟干細胞[9,16-17],成體心臟中的心肌細胞基本由已經存在的心肌細胞增殖而來[9].那么上述兩個遺傳工具便可以深入研究該領域的遺留問題,首先結合Ki67tgRFP與單細胞測序發現損傷情況下新生的小鼠心臟會出現增殖的心肌細胞,而成體的小鼠心臟在損傷情況下并不會出現增殖的心肌細胞信號[15].進一步利用Ki67IRES-CreERT2基因敲入小鼠進行譜系示蹤發現,隨著時間的推移,小鼠的心肌細胞增殖能力越來越弱,與Reza實驗室[12]的研究結果一致.在心肌梗死損傷后,譜系示蹤結果顯示非心肌細胞響應MI的損傷進行了增殖,但是在損傷區基本沒有發現被標記的心肌細胞,損傷邊緣區、遠離損傷區與未進行損傷的對照組被標記的心肌細胞數目基本無差異——4周之內發生過Ki67表達的心肌細胞占總心肌細胞的0.1%左右[15].這說明生理狀態下心肌細胞以極緩慢的速度進行增殖,并且這種增殖并不會因為被心肌梗死損傷刺激而變快.

值得注意的是,Ki67的表達貫穿整個細胞分裂周期,如果心肌細胞僅發生DNA復制或者發生后續的核分裂而不發生胞漿分裂,那么該細胞也會表達Ki67.因此,被熒光蛋白標記的信號要大于真正發生細胞分裂的信號,說明成體心臟中心肌細胞的增殖比例要比檢測到的更低.另一方面,目前使用的譜系示蹤存在技術上的局限,單次或者幾次他莫昔芬(tamoxifen)的注射很難捕捉到Ki67啟動子還未活躍但是在追蹤的時間歷程中Ki67啟動子活躍起來的細胞活動,在這一程度上,上述譜系示蹤技術又遺漏了真實的細胞增殖的信號.在心肌細胞增殖領域捕捉真實的心肌細胞分裂仍然是一個值得進一步研究的科研問題.

上述研究普遍認為隨著小鼠年齡的增長,心肌細胞的增殖能力逐步降低.但是2014年,一項關于在青春期前小鼠心肌細胞增殖的研究引起了爭議[18].該研究認為在小鼠青春期前的14天晚上到15天早上心肌細胞增殖顯著升高,并且這種增殖集中在左心室的心內膜一側.隨后另外兩篇報道提出異議[19-20],認為在青春期前的這段時間心肌細胞的增殖基本是隨著時間的推移而下降的,不存在一天內心肌細胞增殖速率顯著升高又顯著下降的現象.

2 成體心臟心肌細胞增殖的分子基礎

2.1 細胞周期相關基因

早在2004年,就有研究指出細胞周期蛋白Cyclin A2過表達會引起出生后的心肌細胞增殖升高[21].進一步的探究表明,Cyclin A2過表達的轉基因小鼠在心肌梗死后相較于對照組野生型小鼠具有增強的心臟功能和較少的心肌損傷[22].Cyclin A2過表達促進心肌增殖、降低心臟損傷的作用同樣適用于心肌梗死后的豬模型[23].利用腺病毒載體在損傷區原位注射過表達Cyclin A2的腺病毒可起到增強心臟功能、促進心肌細胞增殖的作用.利用MADM分析系統[10],Mohamed等[24]發現組合型的細胞周期蛋白CDK1/CCNB/CDK4/CCND在體外和體內均能引起心肌細胞的增殖,這種刺激心肌細胞增殖的組合可以被簡化為抑制Wee1與TGFβ信號通路同時組合周期蛋白CDK4/CCND.抑制細胞周期的p21的抑制基因——REST對于心臟再生中的心肌細胞增殖具有重要的促進作用[25].

2.2 轉錄因子

Yap是Hippo信號通路的“明星”分子,在各種生物學功能中具有重要作用[26-27].Yap作為轉錄因子可以啟動下游許多基因的表達.通過敲除Hippo上游基因Salv可起到過表達Yap的效果,基因敲除(Yap過表達)后小鼠心臟變大,而這種變大主要是由心肌細胞增殖升高引起的[28].另一方面,Yap敲除的小鼠表現出心臟變小,MI之后恢復變差的表型[29-30].在成體心臟中過表達持續激活的Yap會導致心臟心肌細胞持續增殖,心肌細胞數目變多,心室壁變厚[31].心肌細胞的這種變化是因為Yap被激活的染色體打開了部分分子位置.其他轉錄因子如Tbx20[32],BRG1[33],ERBB2[34],ERBB4[35]均具有促進心肌細胞增殖的作用.而Meis1[36]在心肌細胞中被敲除后對心肌細胞的增殖具有促進作用.

2.3 微小RNA

微小RNA(microRNAs,miRNAs)作為一類長度為20～25個核苷酸的單鏈非編碼RNA,在體內通過同源重組結合到信使RNA(messenger RNAs,mRNAs)的3’端非編碼區上進行基因的轉錄后調控[37-38].通過高通量的篩選結合進一步的體外實驗得出微小RNA hasmiR-590-3p與has-miR-199a-3p能夠引起出生后的心肌細胞增殖,而不引起心臟成纖維細胞的增殖,通過腺病毒載體過表達這兩種miRNA,成體心肌細胞的增殖也會升高,并且有助于提高MI后的心臟功能[39-40].MiR99/100信號通路在心臟再生中從斑馬魚到小鼠是保守的,但是在損傷后無法自激活.外源表達該信號通路的基因使得成體心肌細胞在體外可以增殖[41].關于miRNA促進心肌細胞增殖的研究從小動物逐漸走向大動物并且一步步在向人體接近.利用人源多能干細胞分化來的心肌細胞(human induced pluripotent stem cellsderived cardiomyocytes,hiPSC-CM)體外培養篩選出對人源心肌細胞體外增殖有促進作用的miRNAs,發現這些miRNA大部分都作用于Hippo信號通路.抑制單個miRNA不足以影響心肌細胞的增殖,但是Yap在心肌增殖中有著不可或缺的作用[42].最近發表的一項研究將之前篩選出的miRNA——has-miR-199a利用腺病毒過表達到心肌梗死手術后的豬的心臟損傷區,發現過表達之后豬心臟損傷區變小,心臟功能增強,心肌細胞增殖升高[43].這為臨床治療心臟疾病提供了新思路,但是值得注意的是,在后期由于miRNA的表達不受控制,75%的實驗豬死于突發性的心律不齊.

調控心肌細胞增殖的分子基礎千千萬萬,各有各的重要性.深入研究調控心肌細胞增殖的分子網絡,有助于調控心臟再生,為心臟疾病的臨床治療提供借鑒.

3 成體心臟心肌細胞增殖與所在“環境”

3.1 低氧環境

在許多組織器官中,干細胞或者祖細胞多存在于由缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor 1 alpha,Hif-1α)所維持的低氧環境中[44-45].Kimura等[46]利用Hif-1α的氧依賴降解(oxygen-dependent degradation,ODD)域在正常氧含量下引導Hif-1α降解,而低氧含量下維持Hif-1α的蛋白穩定的特性將ODD域融合到CreERT2的C端,那么正常氧含量下表達出的CreERT2被降解,低氧含量下的CreERT2被穩定.當他莫昔芬(tamoxifen)誘導時,低氧環境中的CreERT2入核識別loxp位點標記目的細胞.被標記的心肌細胞展現出增殖心肌細胞的特性,而且在整個心臟上分布于靠近心內膜以及心內膜心外膜之間的區域,在心外膜一側分布較少[46].

心臟內部的低氧環境孕育出一批具有增殖特性的心肌細胞,外部環境的低氧是否也能誘導出增殖心肌細胞？答案是可以的.將成體小鼠的飼養環境氧含量在2周內緩慢降低到7%并維持兩周,發現心肌細胞的DNA損傷減少,心肌細胞數目增多,心臟變大,并且損傷后恢復更好[47-48].

低氧是許多再生器官的一個共同特征,雖然生物體不能忍受長時間的低氧,但是短時間的低氧能夠引起部分心肌細胞重新進入細胞周期進行增殖,這給心臟再生研究領域提供了新的思路.

3.2 孕期

已有研究發現懷孕后的母鼠心肌細胞增殖變快[49],而這種增殖變快是通過血液中含量上升的調節性T細胞(regulatory T cell,Treg)引起的,殺死血液中的Treg后心肌細胞增殖變緩.Treg細胞作為一種抗炎細胞因子[50],在孕期母體血液中上調Treg水平可促進對胎兒的免疫耐受[51].

免疫系統遍布全身且有許多值得挖掘的問題,免疫系統的加入使心肌細胞增殖領域的研究更加全面.

3.3 運動

運動作為一種健康的生活方式被認為可以有效防治多種心血管疾病[52],并且可以通過多種細胞和分子機制促進心臟再生[53].Vujic等[54]利用2012年Steinhauser等[8]使用的檢測增殖技術檢測到當小鼠每天在轉輪上運動5.6 km左右,并持續運動8周,心肌細胞的增殖速率變快.8周內利用同位素摻入檢測到15N+心肌細胞的概率由正常活動小鼠的1.24%上調到運動小鼠的3.62%,并且運動小鼠的15N+心肌細胞的單核二倍體心肌細胞數目增多[54].在此之前也有研究表明,游泳可以促進心肌細胞數目的增多[55].運動促進心肌細胞的增殖研究目前基本停留在現象發現階段,仍需要結合分子調控網絡進行進一步的研究.

3.4 周邊細胞衰老的微環境

細胞衰老在生理以及病理條件下均起重要作用[56],進一步研究發現瞬時的細胞衰老促進發育與再生[57-58].最近“背靠背”的兩項研究認為,新生期心臟損傷過程中出現的衰老的成纖維細胞促進了心臟修復過程中心肌細胞的增殖[59-60].這兩項研究也為后續成體期心臟損傷修復中心肌細胞增殖的研究開辟了新思路.

4 從心肌細胞自身出發探究細胞增殖

細胞內含有兩套同源染色體被稱為二倍體,當細胞內染色體多于這個數量時,無論是分布在一個核內還是分布在幾個核內都被稱為多倍體[61].多倍體在不同組織器官中對于增殖的作用不同,多倍體的肝臟細胞就貢獻到肝臟的增殖中[62].那么,在心臟心肌細胞中多倍體起什么作用呢？

經常與不同物種心臟的高再生與低再生能力聯系在一起的就是心肌細胞不同的DNA含量[35,63-64],更具體一些,低再生能力的心臟含有大部分的多倍體心肌細胞[65].斑馬魚作為擁有高再生能力心臟的物種,心肌細胞絕大多數為二倍體.Gonzalez-Rosa等[66]利用遺傳學方法將斑馬魚心臟中部分心肌細胞變為多倍體,通過鑲嵌分析發現心肌的多倍體化阻礙了心肌細胞的增殖與心臟再生.進一步對多個物種進行研究,發現是甲狀腺激素上調調節體溫代謝的同時誘導了心肌細胞的多倍體化,使得哺乳動物的心肌細胞增殖能力降低[67].

哺乳動物心肌細胞的多倍體化是一個在成體前就完成的歷程[20],基本無法在成體心肌細胞中將細胞去多倍體化,因此進一步研究心肌細胞多倍體以及抑制其增殖的機制才有可能將這一發現向臨床治療上推進.

有學者認為心肌細胞的肌節結構阻礙了細胞分裂[68],也有學者認為心肌細胞的代謝狀態可能利用氧化磷酸化抑制心肌細胞的增殖[48].

5 結束語

哺乳動物成體心臟中已被證實基本無干細胞可以轉分化為心肌細胞[17],因此心臟受損傷之后的修復基本靠心肌細胞自我增殖完成.已有研究已證明哺乳動物心肌細胞以一定緩慢的比例更新換代[4-5,9],但不同的方法或不同實驗室得出的結論存在差異,研究出領域內具有金標準的心肌細胞更新速率仍然是值得進一步研究的課題.雖有大量研究探索影響心肌細胞增殖的具體機制,但如何調控心肌細胞增殖仍然是一個值得深入研究的領域.完全成熟的心肌細胞與較強的增殖能力之間有著難以逾越的鴻溝,通過關注靶向多個靶點與信號通路的分子可能實現心臟心肌細胞增殖與心臟再生.