代謝組學(xué)在肌少癥研究中的相關(guān)應(yīng)用

歐洲老年肌少癥工作組(EWGSOP)于2010 年將肌少癥定義為“一種以進(jìn)行性骨骼肌肌量和肌力廣泛損失引起的肢體功能障礙、生活質(zhì)量下降和死亡等不良事件風(fēng)險增加的綜合征”[1]。國外大量研究顯示:肌少癥在老年人群中的發(fā)病率約為10%～20%,且其發(fā)生率隨年齡的增加而增加[2-3]。預(yù)計到 2050 年,全球老年肌少癥病人將超過 2 億[1]。到目前為止,肌少癥的診斷方法主要依賴于肌肉質(zhì)量的測定、肌肉強(qiáng)度的評定及肌肉功能的評估[4-5]。但肌少癥缺乏特異性的臨床表現(xiàn),無法被及時認(rèn)識到,且測定、分析及評估過程復(fù)雜，主觀影響較大,肌少癥的診斷仍面臨巨大挑戰(zhàn)。因此,探明新的肌少癥簡易診斷指標(biāo)具有重要意義。

代謝組學(xué)(metabonomics)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后飛速興起的一門學(xué)科,通過單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用包括核磁共振(NMR)、質(zhì)譜 (MS) 和多種色譜在內(nèi)的多種分析化學(xué)技術(shù),可以對生物樣本中的小分子代謝物(分子量<1000)進(jìn)行定性或定量分析,進(jìn)而研究生物體在外界環(huán)境刺激、病理生理變化及自身基因突變作用下的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物譜的變化。目前，代謝組學(xué)已廣泛應(yīng)用于生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、疾病的早期診斷和預(yù)后判斷等方面。本文旨在闡述代謝組學(xué)在肌少癥研究中的進(jìn)展。

1 代謝組學(xué)的研究策略

與“轉(zhuǎn)錄組”和“蛋白質(zhì)組”相平行的“代謝組”,是由生物系統(tǒng)合成的一組代謝物。代謝物是細(xì)胞調(diào)節(jié)過程的最終產(chǎn)物,處于生物系統(tǒng)生化活動的末端,其水平可以體現(xiàn)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)的變化對生物系統(tǒng)的調(diào)控。代謝組學(xué)研究流程包括:納入研究對象、采集和預(yù)處理樣本、提取和分離代謝產(chǎn)物、檢測代謝產(chǎn)物、分析原始數(shù)據(jù)、采用生物信息解析等。

1.1 生物樣品的采集及預(yù)處理 代謝組學(xué)常用的生物樣品主要以體液、組織為主,樣本包括血液、尿液、唾液、腦脊液、肌肉組織等,采集樣本時需考慮時間、部位、種類、樣品群體、性別、年齡、地域等影響因素。體液樣本預(yù)處理主要包括固相萃取、液-液萃取等方法,其目的在于去除可能影響結(jié)果分析的雜質(zhì),對代謝組學(xué)后期的分析意義重大。

1.2 代謝組學(xué)儀器分析技術(shù) 代謝物的檢測依賴于各種分析化學(xué)技術(shù),其中MS技術(shù)與NMR技術(shù)應(yīng)用最廣泛。MS技術(shù)特異性及分辨率高、樣品用量少、分析速度快,可同時對多個化合物進(jìn)行分離和鑒定,但樣品預(yù)處理復(fù)雜,且在檢測過程中難以避免代謝物的損失。MS技術(shù)常與氣相色譜、液相色譜等技術(shù)聯(lián)用,適用于復(fù)雜體系中代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的鑒定。NMR技術(shù)是一種非破壞性技術(shù),采集樣本后可不經(jīng)預(yù)處理直接進(jìn)樣,并具備很好的定性能力。但其靈敏度較MS低,難以保證定量分析的精準(zhǔn)度。近年來越來越多的研究者開始關(guān)注色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),其集NMR的高分離度、高通量及MS的高靈敏度、專屬性于一體,使最終得出的代謝物輪廓信息更全面、更完善,也使各分析技術(shù)互相驗證結(jié)果，進(jìn)而達(dá)到優(yōu)勢互補(bǔ)。

1.3 數(shù)據(jù)處理技術(shù) 數(shù)據(jù)處理主要包括單變量、多變量2種分析方法[6]。單變量分析法主要用于分析代謝產(chǎn)物間的差異。多變量分析法可實現(xiàn)不同樣本間的聚類描述、原始變量中潛在生物標(biāo)志物的篩選等。

2 代謝組學(xué)在肌少癥方面的研究進(jìn)展

目前,國際上已達(dá)成共識的肌少癥發(fā)病原因包括肌肉蛋白質(zhì)凈合成減少、骨骼肌纖維數(shù)量下降、細(xì)胞氧化損傷及修復(fù)受損。肌少癥的診斷使用較多的是 EWGSOP 推薦的肌少癥篩查策略[1],包括肌肉質(zhì)量(簡稱“肌量”)減少、肌肉力量(簡稱“肌力”)下降及軀體功能減退。其中,四肢骨骼肌質(zhì)量指數(shù)[ASMI,四肢肌量(ASM)/身高2] 低于同種族同性別的年輕健康成人2 個標(biāo)準(zhǔn)差(SD)即為肌量減少,肌力以握力(HGS)為測定指標(biāo),軀體功能以尋常步速為測量指標(biāo)。近年來,國內(nèi)外學(xué)者就肌少癥相關(guān)的肌量及肌力進(jìn)行了大量研究,考慮到正常人25歲開始肌肉纖維的體積和質(zhì)量開始損失[7],為了提供早期代謝標(biāo)志物,研究者們將相關(guān)年輕人群也納入了研究范圍[8],經(jīng)綜合、反復(fù)檢測,發(fā)現(xiàn)了與肌少癥相關(guān)的新型代謝物及代謝途徑。

2.1 氨基酸代謝 大量研究表明,氨基酸可以有效刺激年輕和老年肌肉蛋白質(zhì)的合成[9-11]。研究者在老化的腓腸肌中測量到20種經(jīng)典蛋白原氨基酸中的除甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺以外的16種氨基酸分解代謝明顯增加,其分解的游離氨基酸代謝成為乙酰CoA進(jìn)入三羧酸(TCA)循環(huán)。在老年人腓腸肌中，泛素蛋白酶體途徑較成人活性更大[12],并且該途徑可能在禁食狀態(tài)下隨著年齡增長而過度活躍。已被認(rèn)為是肌肉損傷標(biāo)志物的3-甲基組氨酸和游離氨基酸在老年人腓腸肌中也被發(fā)現(xiàn)有所增多[13]。隨著年齡的增長,血漿和肌肉中游離脯氨酸-羥脯氨酸(膠原蛋白的一種二肽成分)、反式-4-羥基脯氨酸(膠原蛋白的一種氨基酸修飾)水平逐漸降低,反映了老化過程中膠原蛋白的更新減少和沉積、交聯(lián)增加,導(dǎo)致了肌肉僵硬并降低了老年人的關(guān)節(jié)活動性。在尿液和肌肉中,C-糖基色氨酸[類似于羧甲基賴氨酸(CML)的非酶依賴性晚期糖基化產(chǎn)物]隨年齡的增長而增加,而在人群研究中,CML與老年人行走速度緩慢、HGS下降有關(guān)。血漿中的支鏈氨基酸(例如異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸)、非支鏈氨基酸天冬氨酸和谷氨酸被相繼證實與肌量、肌力有一定相關(guān)性。肌肉組織富含的賴氨酸(一種必需氨基酸),其代謝產(chǎn)物哌啶酸可以刺激蛋白質(zhì)合成速率增加,促進(jìn)賴氨酸對骨骼肌蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換的影響,與肌量和肌力呈正相關(guān),但與年齡呈負(fù)相關(guān),這些發(fā)現(xiàn)表明,哌啶酸可能是肌少癥的潛在早期標(biāo)志物[14]。

2.2 糖代謝[15-17]大量研究顯示,老年骨骼肌中糖酵解代謝明顯減少,包括糖酵解、糖原分解、戊糖磷酸途徑中間體的累積。丙酮酸隨著年齡的增長而增多,但檸檬酸鹽、琥珀酰肉堿(琥珀酰-CoA的替代標(biāo)志物)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)隨年齡的增長而降低。丙酮酸的累積表明，丙酮酸脫氫酶的表達(dá)或活性受到損害。有研究顯示,丙酮酸脫氫酶和6-磷酸果糖-2-激酶/FBP磷酸酶表達(dá)的年齡相關(guān)性降低與肌量降低相關(guān)[18]。NAD是TCA循環(huán)和線粒體生物發(fā)生的關(guān)鍵輔助因子,這與線粒體功能障礙的代謝組學(xué)特征一致,表明隨著年齡增長,肌肉中TCA循環(huán)和三磷酸腺苷(ATP)產(chǎn)生受損。另外,隨著年齡的增長,腓腸肌中包括富馬酸鹽、蘋果酸鹽、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)在內(nèi)的糖酵解中間體有所減少,但與果糖生成相關(guān)的山梨醇、幾種戊糖磷酸途徑中間體(核糖、核酮糖、核酮糖-5-磷酸和木酮糖-5-磷酸)、糖原中間體(麥芽四糖、麥芽三糖、麥芽糖)隨著年齡的增長而增加,這表明隨著年齡的增長,肌肉中的葡萄糖代謝逐漸轉(zhuǎn)向山梨糖醇和戊糖途徑[19]。在血漿生物標(biāo)志物中,1,5-脫水葡萄糖醇、2′-脫氧胞苷和焦谷氨酰胺與腓腸肌的代謝水平顯著相關(guān)。

2.3 脂質(zhì)代謝[20-25]脂肪可分解生成甘油和脂肪酸,脂肪酸進(jìn)一步經(jīng)β-氧化代謝。關(guān)于老年腓腸肌的研究顯示:線粒體的異常可能會影響β-氧化,導(dǎo)致游離脂肪酸水平增高。已有動物及人體代謝組學(xué)研究表明,不完全脂肪酸氧化隨著年齡的增長而增長。實驗證實，老年腓腸肌中甘油、甘油-3-磷酸鹽、3-羥基丁酸鹽、膽堿、甘油磷酸膽堿、棕櫚油酸酯等單不飽和脂肪酸的水平會隨著年齡的增長而增長,這表明老年人脂肪分解增加但相關(guān)的組織攝取減少。關(guān)于老年人比目魚肌的相關(guān)研究顯示,可以改變細(xì)胞器膜脂質(zhì)組學(xué)特征，使其適應(yīng)衰老的多種甘油磷脂(GPL)隨年齡的增長呈現(xiàn)出減少的趨勢。肉毒堿、低分子量酰基肉堿在兩種肌肉中均隨年齡的增長呈降低趨勢。另外,肌細(xì)胞內(nèi)的脂滴會隨著年齡的增長而增加,脂滴的增加易形成脂肪浸潤，進(jìn)而造成游離脂肪酸的累積,這一過程與肌力呈負(fù)相關(guān)。

3 代謝組學(xué)對于肌少癥探索的展望

肌少癥對老年人健康產(chǎn)生的危害、對醫(yī)療健康體系帶來的沉重負(fù)擔(dān)已日益凸顯,其發(fā)病機(jī)制、早期診斷、實驗室輔助檢查、疾病分型與分期、治療與預(yù)后尚在探索階段,如何更全面、更深入地了解肌少癥并予以精準(zhǔn)預(yù)防和治療迫在眉睫。代謝組學(xué)以復(fù)雜生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)的終端產(chǎn)物為研究對象,結(jié)合生物信息學(xué)分析,可以掌握個體或一群人生理狀態(tài)的豐富信息,進(jìn)而更綜合地了解整個系統(tǒng)生物學(xué)[26]。相比于基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué),代謝組學(xué)采樣方便,技術(shù)通用,無需建立龐大的數(shù)據(jù)庫,可放大基因和蛋白質(zhì)的變化,在尋找疾病潛在生物標(biāo)志物、探索發(fā)病機(jī)制、觀察預(yù)測功能結(jié)果的生物轉(zhuǎn)變方面獨(dú)具優(yōu)勢[27]。近年來,代謝組學(xué)在肌少癥領(lǐng)域的研究逐漸受到關(guān)注,但多數(shù)僅停留在動物實驗階段,動物實驗和臨床研究存在的巨大差異，該學(xué)科本身較高的技術(shù)要求以及臨床驗證方面的難度,使其在肌少癥的相關(guān)研究中仍面臨巨大挑戰(zhàn)。如何通過代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)肌少癥的早期生物標(biāo)志物并進(jìn)行有效的干預(yù),仍有待進(jìn)一步探索。