葛根中葛根素提取工藝研究

孫艷雪 王玉華 楊 易 張 燁

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110

葛根[1]是豆科植物甘葛藤(粉葛)PuerariathomsoniiBenth.或野葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi.的根。味甘、辛，性涼。 歸脾、胃、肺經(jīng)。有[2-4]解肌退熱、透疹、生津止渴、升陽止瀉、通經(jīng)活絡(luò)、解酒毒之功效。常用于外感頭痛發(fā)熱、項背強痛、麻疹不透、口渴、消渴、熱痢、泄瀉、眩暈頭痛、中風(fēng)偏癱、胸痹心痛、酒毒傷中。葛根中含有多種有效成分，主要為葛根素。近代有關(guān)研究表明，葛根素對突發(fā)性耳聾以及心腦血管疾病等有較好的療效[5-6]。隨著人們對葛根的藥理作用進(jìn)行深入研究，將其當(dāng)作原料加工制作的各類食品藥品廣受國內(nèi)外民眾好評。目前常用于葛根素提取的方法有醇提法、水提法、微波輔助萃取法、超聲波輔助法等。

1 材料與方法

1.1 儀器 TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；電子天平TA1003(上海菁海儀器有限公司)；HH-2恒溫水浴鍋(常州市江南實驗儀器廠)；N-1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYEL4)。

1.2 試藥 葛根飲片購于國藥控股國大藥房內(nèi)蒙古有限公司，用粉碎機超微粉化后，用密封袋分兩次包裝備用；葛根素標(biāo)準(zhǔn)品(來源于中國食品藥品檢定研究院)。95%乙醇、實驗過程中所用蒸餾水、無水乙醇。

2 方法與結(jié)果

2.1 葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱量葛根素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于50 mL的容量瓶中，加30%乙醇定容，即配制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的葛根素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL置于25 mL容量瓶中，加30%乙醇定容。以30%乙醇作空白對照，在波長為250 nm處測定吸光度，并繪制吸光度和質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇濃度對葛根素提取率的影響 精密稱取3份10.000 g的葛根粉，分別加入相95%乙醇、75%乙醇和50%乙醇(固液比1∶20 g/mL)，在90 ℃恒溫水浴下用索氏提取器回流提取60 min，所得溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑后用30%乙醇稀釋，取樣，在250 nm處測定吸光度并記錄數(shù)據(jù)。

2.2.2 提取時間對葛根素提取率的影響 稱取3份10.000 g的葛根粉，按照固液比1∶20(g/mL)加入相應(yīng)量的95%乙醇，在90℃恒溫水浴下分別用索氏提取器回流提取90 min、75 min、60 min，所得溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑后用30%乙醇稀釋，取樣，在250 nm處測定吸光度并記錄數(shù)據(jù)。

2.2.3 提取溫度對葛根素提取率的影響 稱取3份10.000 g的葛根粉，按照固液比1∶20(g/mL)加入相應(yīng)量的95%乙醇，分別在90℃、85℃、80℃恒溫水浴下用索氏提取器回流提取60 min，所得溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑后用30%乙醇稀釋，取樣，在250nm處測定吸光度并記錄數(shù)據(jù)。

2.2.4 乙醇濃度對葛根素提取率的影響 稱取3份10.000 g的葛根粉，分別按照固液比1∶15、1∶20、1∶25(g/mL)加入相應(yīng)量的95%乙醇，在90℃恒溫水浴下用索氏提取器回流提取60 min，所得溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑后用30%乙醇稀釋，取樣，在250 nm處測定吸光度并記錄數(shù)據(jù)。

2.3 正交試驗 葛根素提取的因素很多，通過單因素試驗確定了各因素的最優(yōu)水平。但考慮到各因素之間的相互影響，以紫外分光光度法測得的葛根素含量為參考指標(biāo)，采用正交L9(34)試驗設(shè)計，研究葛根素的最佳提取條件。正交試驗因素水平見表1。

2.4 葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線 以葛根素質(zhì)量吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，可獲得線性回歸方程：y=0.1313x-0.101(R2=0.9982) 式中：y為吸光度；x為質(zhì)量濃度(μg/mL)。結(jié)果表明，葛根素質(zhì)量濃度在1.6～9.6 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。如圖1所示。

表1 正交試驗因素水平

2.5 單因素試驗

2.5.1 乙醇濃度對葛根素提取率的影響 選擇最合適的溶劑從樣品基質(zhì)中提取目標(biāo)分析物是開發(fā)提取方法的基礎(chǔ)步驟。離子液體作為一種環(huán)境友好的綠色溶劑，在過去的幾十年中得到了越來越多的關(guān)注。然而，離子液體也有一些缺點，包括太昂貴而不能大規(guī)模用于商業(yè)生產(chǎn)，難以再生和有一些毒性等。為此，對不同濃度乙醇對葛根素提取率的影響進(jìn)行研究。前人對不同乙醇濃度下超聲法提取葛根素的提取率進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)50%乙醇才是最佳選擇。而從表1、圖2可以看出當(dāng)乙醇濃度為75%時提取出的葛根素濃度最高，由此可知，增加乙醇濃度可以提高提取效率。

2.5.2 提取時間對葛根素提取率的影響 如表2、圖3所示，隨著提取時間的延長，葛根素的提取率75 min達(dá)到最大值，隨后提取時間越長，提取率越低，這可能是由于在較長時間的加熱過程中部分葛根素被破壞所致。而前人同樣對不同提取時間下超聲法提取葛根素的提取率進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)75 min是最優(yōu)選擇。

表1 乙醇濃度對葛根素提取率的影響

表2 提取時間對葛根素提取率的影響

2.5.3 提取溫度對葛根素提取率的影響 圖4表明，在 85 ℃溫度時，葛根素的產(chǎn)率達(dá)到頂峰，這可能是由于升高溫度導(dǎo)致細(xì)胞基質(zhì)的打開，從而提高葛根素的提取效率，也可能是在高溫下，溶劑粘度降低，擴(kuò)散系數(shù)增大，從而提高了提取效率。而在 90 ℃時，葛根素的產(chǎn)率反而下降，這可能是高溫下葛根素的分解和燒焦所致。而前人同樣對不同溫度下超聲法提取葛根素的提取率進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn) 85 ℃是最優(yōu)工藝條件。

2.5.4 固液比對葛根素提取率的影響 固液比是提高葛根素提取率的一個重要因素。一般來說，溶劑體積越大，提取率越高,然而較高的溶劑體積會使操作困難，導(dǎo)致不必要的浪費。采用不同的固液比進(jìn)行了一系列實驗，以評價固液比的影響。從表4、圖5可以看出葛根素提取率在固液比1∶25時達(dá)到頂峰。

表3 提取溫度對葛根素提取率的影響

表4 固液比對葛根素提取率的影響

2.6 正交試驗 對表5數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析可得，極差最大的因素是乙醇濃度，葛根素濃度提取率最高的乙醇濃度為75%，這與單因素試驗的結(jié)果一致，說明乙醇濃度的最佳選擇為75%；其次是提取溫度，根據(jù)上述結(jié)果，單因素試驗確定在 85 ℃時葛根素提取率最高，而由于各因素間的相互作用，正交試驗最終決定采用 90 ℃作為最佳提取溫度；再次是固液比，從單因素試驗結(jié)果可以看出，葛根素提取率在固液比1∶20時達(dá)到頂峰，但同樣由于各因素間的相互作用，同時考慮到試驗誤差的影響，最終選用1∶25為最佳固液比；極差最小的因素是提取時間，單因素試驗與正交試驗一致得出了提取時間為 75 min時提取效果最佳。綜上所述，在乙醇濃度為75%、提取溫度為 90 ℃、固液比為 1∶25的條件下提取75 min所得葛根素濃度最高，提取率最高。

表5 正交試驗表

2.7 驗證實驗 在最佳提取條件(即乙醇濃度為75%、提取溫度為 90 ℃、固液比為1∶25、提取時間為75 min)下，重復(fù)3次，所得結(jié)果見表6。

表6 驗證實驗表

結(jié)論：經(jīng)過驗證，該工藝有效可靠。

3 討論

本實驗經(jīng)過單因素試驗與正交試驗相結(jié)合的方法并計算K值與R值，結(jié)果表明影響葛根素提取效率的因素按值依次遞減為A>D>C>B，因此，當(dāng)乙醇濃度、提取時間、固液比、提取溫度分別為A2、B2、C3、D1(即75%、75 min、1∶25、90℃)時，可獲得最高的葛根素濃度。

本實驗所得結(jié)果與前人超聲波輔助提取葛根黃酮的工藝進(jìn)行對比，研究發(fā)現(xiàn)，乙醇熱回流法提取葛根素的提取率比超聲法略高，但二者相比，乙醇熱回流法溶劑用量大，耗時長、能耗高、且由于經(jīng)常需要加熱處理，可能會造成原料的浪費，操作難度大；而超聲法具有效率高、耗時短、雜質(zhì)少、溶劑用量少、成本低、綠色環(huán)保等特點，所以其在葛根等藥材提取的工業(yè)化生產(chǎn)上更加具有良好的應(yīng)用前景。

葛根藥理活性良好，毒副作用較少，其化學(xué)成分葛根素除了具有心肌保護(hù)作用和缺血再灌注損傷的保護(hù)作用外，還具有抗氧化、降血糖，降血壓及降血脂等作用[7-12]。因此葛根是一種發(fā)展?jié)摿薮蟮乃幬铮绾胃咝ЬG色，工業(yè)化的對葛根有效成分進(jìn)行提取成為當(dāng)今人們的熱門話題。本實驗通過對乙醇熱回流法提取葛根素的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，同時與超聲法進(jìn)行對比，以期為其他葛根素提取研究提供理論依據(jù)。