檳榔內(nèi)生真菌的分離與鑒定

海南大學(xué)園藝學(xué)院, 海南 海口 570228

檳榔(ArecacatechuL .)為棕櫚科檳榔屬常綠喬木，原產(chǎn)于東南亞，目前主要種植于我國的海南省，產(chǎn)量已經(jīng)占總產(chǎn)量的90%以上，是海南省除橡膠產(chǎn)業(yè)之外的第二大支柱產(chǎn)業(yè)[1-2]。經(jīng)國家批準(zhǔn)，檳榔在海南省已經(jīng)被列入生態(tài)經(jīng)濟(jì)林樹種。檳榔還具有重要的藥用價值，位居中國四大南藥之首，其果實(shí)、種子、皮、花均可入藥。

植物內(nèi)生真菌是指那些能在健康植物的不同組織或者細(xì)胞內(nèi)生存，對植物組織不會引起病害癥狀的真菌[3]。一些內(nèi)生真菌可形成與宿主植物具有明顯區(qū)別的代謝系統(tǒng)，進(jìn)而產(chǎn)生具有很多豐富作用的次生代謝產(chǎn)物[4]。而藥用植物的內(nèi)生真菌的研究是從1993年開始，由于能從短葉紫杉的樹皮中分離出紫杉醇，這給尋找功能性植物內(nèi)生真菌提供了一個可靠的依據(jù)。種類豐富的內(nèi)生真菌，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)多種多樣，作用十分豐富的次生代謝產(chǎn)物，這給今后其他植物的病蟲害防治提供一個新的思路[5-7]。由于內(nèi)生真菌與宿主之間的聯(lián)系與作用，使得在植物中內(nèi)生真菌的研究具有十分重要的優(yōu)勢。利用現(xiàn)代的技術(shù)手段，提高目標(biāo)化合物的產(chǎn)量，避免了資源浪費(fèi)，同時還可以保護(hù)環(huán)境[8]。因此，在人們探索生物活性物質(zhì)資源時，內(nèi)生真菌具有其獨(dú)特優(yōu)勢。

目前，有關(guān)檳榔內(nèi)生真菌分離鑒定及其次生代謝產(chǎn)物相關(guān)的研究報道很少。宋薇薇等[9]從檳榔根、葉、花中分離純化得到47株內(nèi)生真菌，鑒定屬于8個屬。很多研究報告發(fā)現(xiàn)木霉屬真菌可產(chǎn)生一些生物堿以及其他活性物質(zhì)，可見，研究檳榔內(nèi)生真菌對新活性物質(zhì)的收集有良好的前景。本研究以檳榔根，葉，果為研究對象，根據(jù)ITS序列分析鑒定組織內(nèi)生真菌，為進(jìn)一步開展檳榔內(nèi)生真菌資源收集與藥用價值開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本研究的植物材料采自2018年9月份萬寧市山根鎮(zhèn)(N18°58′8.52″, E110°28′56.28″)和萬寧市北大鎮(zhèn)(N18°91′8.50″, E110°29′64.30″)健康的檳榔樹(ArecacatechuL .)。主要試劑：PDA固體培養(yǎng)基；馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)液體培養(yǎng)基；8 %次氯酸鈉溶液；75 %酒精；真菌基因組DNA提取試劑盒(北京索萊寶Solarbio科技有限公司)；測序引物序列為ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；ITS1F：5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'(由天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成)。

1.2 檳榔內(nèi)生真菌分離 采取健康新鮮的檳榔根、葉、果，用超純水沖洗干凈后使用2.6%次氯酸鈉和75%乙醇浸泡，浸泡時間設(shè)置5個梯度25個組合(次氯酸鈉設(shè)置時間梯度: 30 s、45 s、60 s、75 s、90 s; 乙醇設(shè)置時間梯度: 30 s、60 s、90 s、120 s、150 s)，再用無菌水沖洗3～5次。根用消毒手術(shù)刀切去頭尾，再把中間部位切成0.5～1 cm長的小段；用消毒手術(shù)刀將葉邊緣部分去除,切分成0.5 cm×0.5 cm大小的組織塊；用消毒手術(shù)刀將果縱切后橫切為0.5 cm×0.5 cm。將配好的PDA培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，滅菌均采用LDZX-50KBS高溫高壓滅菌鍋(生產(chǎn)于上海申安有限公司)，滅菌條件為121℃、20min。把各組織塊分別放在滅菌的PDA固體培養(yǎng)基平板上，2 min后取出放入另外干凈PDA固體培養(yǎng)基平板上，再將最后一次清洗組織塊的無菌水用移液槍吸取少量滴入PDA培養(yǎng)基中，并在實(shí)驗(yàn)過程中放入空白對照，于溫度25℃恒溫箱中培養(yǎng)5 d左右，多次純化后試管保存。

1.3 測序鑒定 從保存的試管中刮取菌絲體接種到馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)液體培養(yǎng)基中，放入50 rpm/min恒溫?fù)u床在25℃、黑暗條件下進(jìn)行培養(yǎng)，參照真菌基因組DNA提取試劑盒的使用方法提取檳榔內(nèi)生真菌DNA，再進(jìn)行PCR反應(yīng)(反應(yīng)體系設(shè)置為25 μL,反應(yīng)條件為94℃ 5 min; 94℃ 40 s,55℃ 40 s, 72℃ 55 s, 35個循環(huán);72℃ 10 min, 4℃ ∞)。采用AGT9601PCR擴(kuò)增儀(生產(chǎn)于杭州安杰思醫(yī)學(xué)科技有限公司)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送往鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進(jìn)行測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理 用Excel 2016軟件處理數(shù)據(jù)，NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行序列比對，MEGA5.2軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 檳榔內(nèi)生真菌分離及DNA擴(kuò)增 通過平板分離法對檳榔內(nèi)生真菌進(jìn)行分離純化，表面消毒檢測情況顯示對照組無明顯菌落長出，表明試驗(yàn)材料表面已消毒徹底，分離獲得的菌株來自檳榔組織內(nèi)部。將分離得到的檳榔內(nèi)生真菌進(jìn)行DNA提取及rDNA-ITS序列PCR擴(kuò)增，1.0 %瓊脂糖凝膠電泳顯示，擴(kuò)增序列條帶在600 bp左右。如圖1所示。

2.2 檳榔內(nèi)生真菌鑒定 經(jīng)過測序鑒定獲得了53株檳榔內(nèi)生真菌，從根、葉和果中分離獲得到的內(nèi)生真菌分別占14株、25株和14株(表1、表2)。通過BLAST比對初步鑒定為9個屬，分別為曲霉屬Aspergillus、刺盤孢屬Colletotrichum、鐮刀菌屬Fusarium、毛雙孢屬Lasiodiplodia、Meyerozymasp.、青霉屬Penicillium、擬莖點(diǎn)霉屬Phomopsis、Pleosporalessp.、木霉屬Trichoderma。基于ITS序列分析將G9-1-2、F20、G14、Y27、F13、F28、G21建立系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，各菌株與其相似菌株的支持度可達(dá)100 %。木霉屬Trichoderma在檳榔內(nèi)生真菌中為優(yōu)勢菌屬，菌株比例達(dá)到了26.42% (表2)；葉部優(yōu)勢菌屬也為木霉屬；而根部的優(yōu)勢菌屬為曲霉屬Aspergillus。

表1 檳榔內(nèi)生真菌 rDNA-ITS 序列的相似性分析

表1 檳榔內(nèi)生真菌 rDNA-ITS 序列的相似性分析

注： “-”表示在相應(yīng)部位沒有分離出該種屬內(nèi)生真菌。

2.3 檳榔內(nèi)生真菌多樣性分析 根據(jù)Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)(H′),檳榔根、葉和果的H′值分別為0.86、1.11和 0.86，其中葉部內(nèi)生真菌的多樣性最高；葉(0.57)比根(0.41)和果(0.41)的E值高，表明葉部內(nèi)生真菌較為豐富且分布均勻。從根、葉和果3個部位的內(nèi)生真菌種類的相似性指數(shù)來看，Cs都在0.8以上，說明各部位之間的真菌種類極為相似(表3)。從檳榔根、葉、果中分離得到的53株內(nèi)生真菌中曲霉屬Aspergillus、刺盤孢屬Colletotrichum、Meyerozymasp.、青霉屬Penicillium、木霉屬Trichoderma在三個部位都存在；而鐮刀菌屬Fusarium只在葉和果中獲得，毛雙孢屬Lasiodiplodia只分布于根和果中，擬莖點(diǎn)霉屬Phomopsis只在根與葉中存在，Pleosporalessp.則在分離于根和果，說明同一菌屬在不同部位分布存在差異(表2)。

表2 菌屬在檳榔各部位的分離比例結(jié)果

表3 檳榔根、葉、果內(nèi)生真菌多樣性

3 討論

自20世紀(jì)70年代，內(nèi)生真菌被廣泛研究，尤其在經(jīng)濟(jì)林木及藥用植物，包括一些藻類、蕨類都發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生真菌[10]。而且在同一種植物中可分離出數(shù)十種內(nèi)生真菌，多則上百種，尤其從熱帶雨林植物中分離獲得的內(nèi)生真菌多樣性突出。本實(shí)驗(yàn)在檳榔不同根、葉、果中分離鑒定了53株內(nèi)生真菌，鑒定為9個屬，其中優(yōu)勢菌屬為木霉屬Trichoderma，且檳榔各組織的內(nèi)生真菌分布也有差異，其葉部內(nèi)生真菌分布較為豐富；而一些菌屬存在于特定組織，例如毛雙孢屬Lasiodiplodia只分布于根和果中。大量的研究也表明，內(nèi)生真菌存在于植物組織內(nèi)，不僅表現(xiàn)了普遍性，而且表現(xiàn)出多樣性。本試驗(yàn)中根、葉和果3個部位的內(nèi)生真菌種類的相似性指數(shù)Cs都在0.8以上，說明各部位之間的真菌種類極為相似。而大多數(shù)植物內(nèi)生菌分布于植物不同的組織和器官內(nèi)，并且宿主植物和內(nèi)生真菌的種屬往往決定了它們的分布情況[11-12]。本實(shí)驗(yàn)在檳榔不同部位分離的內(nèi)生真菌種屬存在差異，這樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能表明檳榔不同組織結(jié)構(gòu)以及不同的營養(yǎng)條件而導(dǎo)致植物體內(nèi)微環(huán)境有差異[13]。木霉屬從檳榔中分離的比例較高，達(dá)到了26.42%，且該屬主要分布于葉部說明該屬內(nèi)生真菌表現(xiàn)出不同的器官或組織偏好性[14]。這與宋薇薇[9]的研究結(jié)果有差異，宋薇薇從檳榔根、葉和花中分離獲得的青霉屬(31.91%)和鐮刀菌屬(27.66%)為優(yōu)勢菌屬，這可能由于種植環(huán)境條件及分離部位的差異造成[15]。

目前，很多學(xué)者對藥用植物的內(nèi)生真菌進(jìn)行深入探索，大量研究表明植物內(nèi)生真菌能產(chǎn)生和宿主植物相同、類似或結(jié)構(gòu)新穎的次級代謝產(chǎn)物，目前在藥用研究及應(yīng)用上有很大的前景。張杰[16]從蛇足石杉莖中分離得到1株產(chǎn)生物堿的內(nèi)生真菌菌株LYS081，初步鑒定也為木霉屬(Trichoderma)。檳榔中檳榔生物堿是主要活性物質(zhì)，而檳榔生物堿有改善胃腸功能，治療糖尿病，促進(jìn)神經(jīng)興奮，預(yù)防癌癥和保護(hù)血管等作用[17]。這為有效挖掘檳榔藥用價值提供了重要線索。因此，本研究對檳榔內(nèi)生真菌的分離鑒定將為檳榔內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物活性研究及新化合物的開發(fā)和挖掘提供了前提條件。