垂枝紅千層內(nèi)生真菌的分離鑒定及其生物活性

李賽妮 陳玉嬋 劉洪新 朱牧孜 章衛(wèi)民

廣東省微生物研究所/華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070

植物內(nèi)生真菌(Endophytic fungi)是一類重要的微生物資源，其生活在植物體內(nèi)的特殊環(huán)境中，在演化過程中與宿主植物形成了互惠共生關(guān)系，能產(chǎn)生與宿主相同或相近的代謝產(chǎn)物，甚至能產(chǎn)生新型生物活性物質(zhì)，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)以及病蟲害的防治等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值，已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域[1]。

垂枝紅千層(Callistemonviminalis)為桃金娘科(Myrtaceae)紅千層屬(Callistemon)植物，原產(chǎn)于澳大利亞，國內(nèi)多個(gè)地區(qū)都有栽種，廣泛用于綠化、園藝觀賞、入藥和制取精油等[2]。紅千層屬植物的化學(xué)成分和生物活性研究表明，其枝葉含有間苯三酚類及黃酮類等化合物[3-5]，具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、殺蟲和免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[6-8]。迄今垂枝紅千層內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物研究未見報(bào)道。為了充分發(fā)掘該植物的內(nèi)生真菌資源，本研究對(duì)采自華南植物園的垂枝紅千層進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離和鑒定，探討垂枝紅千層內(nèi)生真菌的多樣性，并對(duì)分離到的內(nèi)生真菌的發(fā)酵粗提物進(jìn)行抗菌和細(xì)胞毒活性研究，旨在篩選出具有生物活性的菌株，為進(jìn)一步研究其活性代謝產(chǎn)物提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 植物材料、供試菌株及細(xì)胞株 垂枝紅千層健康植株于2016年01月采自廣州華南植物園。

供試指示菌細(xì)菌為金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA) 、大腸桿菌(Escherichiacoli，EC)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis，BS)。

供試腫瘤細(xì)胞株為神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(SF-268)、乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、大細(xì)胞肺癌細(xì)胞(NCI-H460)、肝癌細(xì)胞(HepG-2)。以上所有菌株和細(xì)胞株均保藏于廣東省微生物研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基分離 培養(yǎng)基為PDA雙抗培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，KH2PO43 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，維生素B1 10 mg，瓊脂18 g，蒸餾水1 L；滅菌后分別加入100 μg/mL硫酸卡那霉素和氨芐青霉素。

PD液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g， KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 0.15 g，維生素B110 mg，蒸餾水1000 mL，pH自然，121℃下滅菌30 min。

腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清和1%雙抗(10000 U/mL青霉素和鏈霉素)的RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，混合均勻，4℃冰箱保存。

1.1.3 試劑RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗(10000 U/mL青霉素+鏈霉素)均購自Gibco公司；磺酰羅丹明B(SRB)、二甲基亞砜(DMSO)、氨芐青霉素、硫酸卡那霉素、順鉑(cisplatin)均購自Sigma公司；乙醇、乙酸乙酯、甲醇等其他分析純化學(xué)試劑購于廣州化學(xué)試劑廠，用于基因擴(kuò)增的Taq酶及其他的PCR相關(guān)試劑購于廣州美基生物科技有限公司。

1.1.4 主要儀器YXQ-WY21-600 電熱高壓蒸汽滅菌鍋，廣州市華南醫(yī)療器械有限公司；Mastercycler gradient 5331 PCR儀，Eppendorf公司；MGC-250BP-2 培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；164-5050 Powerpac Basic Power Supply基礎(chǔ)型電泳儀，Bio-Rad公司；DMI3000B倒置顯微鏡，Leica公司；S-3000N掃描電鏡，日立公司；Multiskan酶標(biāo)儀，Thermo公司；2123-2二氧化碳培養(yǎng)箱，Shellab公司；RE-2000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；THZ-C-1搖床，廣州市正一科技有限公司。

2 方法

2.1 內(nèi)生真菌的分離純化 將采集的新鮮樣品用清水沖洗，然后用無菌水漂洗2次，放入75%的乙醇中浸泡1 min，取出后用無菌水漂洗3次，再放入0.1%的升汞溶液中浸泡1 min，取出后用無菌水漂洗3次，用無菌濾紙吸干水分。葉片用無菌剪刀剪去邊緣后剪成約0.5 cm × 0.5 cm的方塊；枝條用無菌手術(shù)剪去兩端，取中間部位剪成1 cm長(zhǎng)的小段；用最后一次漂洗用的無菌水涂板作為陰性對(duì)照。處理好的樣品放入事先準(zhǔn)備好的PDA雙抗平板培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)皿接種4塊相同類型組織塊，26℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，待培養(yǎng)基上可觀察到從組織塊內(nèi)部向周圍長(zhǎng)出菌絲時(shí)，挑取形態(tài)不同的菌落轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)直至純化后，將菌株轉(zhuǎn)接到裝有PDA培養(yǎng)基的斜面上，置于4oC冰箱保存，備用。

2.2 內(nèi)生真菌的鑒定 采用真菌基因組DNA提取試劑盒(Magen)提取內(nèi)生真菌的基因組DNA，作為PCR擴(kuò)增的模板[9]。PCR擴(kuò)增采用真菌rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA ITS)通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，正向)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，反向)[10]擴(kuò)增分離菌株的rDNA ITS區(qū)。PCR采用40 μL反應(yīng)體系，通過ExTaq(TaKaRa)進(jìn)行，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72oC延伸5 min。反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠跑膠驗(yàn)證，將有目的條帶的反應(yīng)產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。獲得的序列通過BLAST程序在GenBank上進(jìn)行相似性序列檢索分析，對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定。

2.3 菌株粗提物浸膏的制備 將4 ℃低溫保藏的菌株分別接種到PDA平板上，27 ℃活化 3 d，挑取各菌株接種到PD液體培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng) 7 d，用四層紗布過濾收集發(fā)酵液。用乙酸乙酯等體積萃取發(fā)酵液4次，合并萃取液于45℃減壓濃縮，得到各菌株粗提物浸膏。取以上各菌株發(fā)酵液粗提物適量，稱重，備用。

2.4 抗細(xì)菌活性測(cè)定 將各供試細(xì)菌接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，用無菌生理鹽水稀釋，配制成 1×105～1×107CFU/mL的菌液。吸取 1 mL菌液于滅菌的培養(yǎng)皿中，倒入已冷卻到合適溫度的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，混合均勻，待冷卻之后放置己滅菌的直徑為 6 mm濾紙片，分別吸取提取液 5 μL滴加于濾紙片上，以DMSO代替樣品提取液作空白對(duì)照，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌以氨芐青霉素作陽性對(duì)照，大腸桿菌以硫酸卡那霉素作陽性對(duì)照。置37℃恒溫箱培養(yǎng)16～24 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況并測(cè)量抑菌圈大小。

2.5 細(xì)胞毒活性測(cè)定 采用SRB法[11]測(cè)定發(fā)酵提取物的細(xì)胞毒活性。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCI-H460、SF-268、MCF-7、HepG-2細(xì)胞，用胰酶消化，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)。臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力大于95%后，用新鮮培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104個(gè)/mL，細(xì)胞接種于96孔板，每孔加入180 μL的細(xì)胞懸液，并設(shè)空白孔調(diào)零，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，每孔加入20 μL待測(cè)樣品，陰性對(duì)照加20 μL培養(yǎng)基，以順鉑作陽性對(duì)照。置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，加入50 μL 50%冷三氯醋酸固定細(xì)胞，4℃放置1 h后用蒸餾水洗滌5次，空氣中自然干燥。然后加入由1%冰醋酸配制的SRB溶液(4 mg/mL)100 μL/孔，室溫中染色30 min，去上清，用1%冰醋酸洗滌5次，空氣干燥。最后每孔加入200 μL濃度為10 mmol/mL的Tris溶液，用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處的吸光度(A)值，按以下公式計(jì)算提取物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率：

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%) = (1-A樣品組/A對(duì)照組) ×100%

3 結(jié)果

3.1 內(nèi)生真菌的分離與鑒定 從垂枝紅千層的莖、葉中分離到29株內(nèi)生真菌，將測(cè)序后獲得的ITS序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析并獲得登錄號(hào)，結(jié)果見表1。從表1可以看出，分離菌株鑒定為17屬20種，未鑒定至種名的有4 株；其中以黑孢霉屬(Nigrospora)、間座殼屬(Diaporthe)和刺盤孢屬(Colletotrichum)為優(yōu)勢(shì)類群，共12株，占分離菌株總數(shù)的41.37%；而菌株A797和A805與最相似物種的相似度較低，分別是96.3%和93.3%，有待進(jìn)一步鑒定。

表1 紅千層內(nèi)生真菌的分離和測(cè)序結(jié)果

表1 紅千層內(nèi)生真菌的分離和測(cè)序結(jié)果

3.2 內(nèi)生真菌的抗細(xì)菌活性 29株內(nèi)生真菌中有9個(gè)屬11株真菌的提取物至少對(duì)1種供試細(xì)菌有抗菌活性(抑菌圈直徑≥8 mm)，占分離菌株總數(shù)的37.9%，對(duì)2種供試細(xì)菌有抑制作用的活性菌株有3株，占分離菌株總數(shù)的10.3 %。其中對(duì)SA和BS都具有較好抑制活性(抑菌圈直徑≥13 mm)的菌株有3株，分別是菌株A797、A798和A809；所有內(nèi)生真菌的提取物對(duì)大腸桿菌均沒有明顯的抑制作用。見表2。

表2 紅千層內(nèi)生真菌提取物對(duì)細(xì)菌的抑制作用

紅千層內(nèi)生真菌提取物對(duì)細(xì)菌的抑制作用

注：“SA”代表金黃色葡萄球菌，“EC”代表大腸桿菌，“BS”代表枯草芽孢桿菌；“SA”和“SB”的陽性對(duì)照為氨芐青霉素，“EC”的陽性對(duì)照為硫酸卡那霉素，作用濃度均為0.2 mg/mL。

3.2 內(nèi)生真菌的抗腫瘤活性 各菌株發(fā)酵液粗提物的體外細(xì)胞毒活性測(cè)試結(jié)果見表3。從表3中可以看出，當(dāng)粗提物的濃度為100 μg/mL時(shí)，29株內(nèi)生真菌中共有6個(gè)屬10株真菌提取物至少對(duì)1種供試細(xì)胞株有抑制作用(抑制率≥50%以上)，占分離菌株總數(shù)的 34.5%；對(duì)4株受試腫瘤細(xì)胞均具有顯著活性(抑制率≥90%以上)的菌株有3株，分別是菌株A781、A785和A805。

表3 紅千層內(nèi)生真菌發(fā)酵粗提物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用 (n=3)

紅千層內(nèi)生真菌發(fā)酵粗提物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用 (n=3)

注：順鉑作為陽性對(duì)照，順鉑和提取物作用濃度均為100 μg/mL。

4 討論

紅千層屬植物的化學(xué)成分和生物活性已有大量的研究報(bào)道。本研究首次對(duì)垂枝紅千層的內(nèi)生真菌多樣性及其生物活性進(jìn)行探索，從中分離獲得了29株內(nèi)生真菌，經(jīng)ITS序列分析鑒定為17屬20種，其中以黑孢霉屬、刺盤孢屬和間座殼屬為優(yōu)勢(shì)類群。通過對(duì)內(nèi)生真菌發(fā)酵粗提物的抗細(xì)菌和抗腫瘤活性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)有9個(gè)屬11株真菌提取物至少對(duì)1種供試細(xì)菌有抗細(xì)菌活性(抑菌圈直徑≥8 mm)，其中菌株P(guān)seudofusicoccumviolaceumA797、AmesiagelasinosporaA798和BotryosphaeriadothideaA809的發(fā)酵提取物，對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均具有較好抑制活性(抑菌圈直徑≥13 mm)；細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)內(nèi)生真菌粗提物濃度為100 μg/mL時(shí)，共有6個(gè)屬10株真菌提取物至少對(duì)1 種受試細(xì)胞株有抑制作用(抑制率≥50% 以上)，其中菌株GuignardiamangiferaeA781、NigrosporasphaericaA785和DiaporthephaseolorumA805對(duì)SF-268、MCF-7、NCI-H460和HepG-2 4種受試細(xì)胞的抑制率均在90%以上。結(jié)果表明，垂枝紅千層內(nèi)生真菌具有較為豐富的物種多樣性，且部分菌株具有較好的生物活性，為進(jìn)一步研究垂枝紅千層內(nèi)生真菌活性代謝產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)，并為開發(fā)利用垂枝紅千層資源提供了科學(xué)依據(jù)。