金銀花提取物對肉牛瘤胃體外發酵、揮發性脂肪酸組成及氣體產生的影響

黃祥元，唐 偉，龍冰雁

反芻動物消化過程產生氫氣、甲烷和二氧化碳，這些氣體是全球變暖的主要因素。甲烷是一種溫室氣體，其導致全球變暖的潛力是二氧化碳的21倍。瘤胃中產生甲烷的能量損失相當于動物飼料總能量的6%～10%（易禮勝等，2002）。所有人為產生的甲烷中大約30%是由腸道排放的，主要來自瘤胃中飼料的發酵。FAO預計，到2050年全球肉類和牛奶產量將翻一番，而這些產量的增加也將對環境產生負面影響。許多化學添加劑具有減少瘤胃甲烷排放的潛力，但這些添加劑要么對有益的瘤胃微生物產生副作用，要么對宿主動物產生毒性。因此，急需尋求安全的方法來改變瘤胃發酵特性。植物提取物包括次生代謝物，已在傳統醫學和食品防腐劑中使用了幾個世紀，植物提取物可作為瘤胃發酵的調控劑來減少甲烷生成（Kim等，2012）。金銀花是一種傳統的藥用植物，在韓國、日本和中國很常見。嚴雪龍等（2016）報道，金銀花提取物具有其他生物和藥物特性，包括抗炎、抗菌、抗病毒，同時也顯示出肝臟保護功能。Park等（2014）研究表明，金銀花甲醇提取物中黃酮類化合物含量約為71.023 g，主要成分為表沒食子兒茶素。表沒食子兒茶素是一種黃烷3醇化合物，包括兒茶素、天然酚、抗氧化劑和濃縮單寧。濃縮單寧與蛋白質緊密結合，根據其來源和使用的濃度顯示出有害和有益的影響，飼用豆科植物的濃縮單寧可通過抑制產甲烷菌來降低瘤胃甲烷的排放。因此，本研究通過體外試驗評估金銀花提取物對瘤胃發酵、揮發性脂肪酸組成及氣體產生的影響。

1 材料與方法

1.1 瘤胃接種與體外培養 以體重為450 kg的肉牛作為瘤胃液供體。苜蓿草和濃縮料按照60∶40的比例加工成全混合日糧，每天分別在早上9點和下午5點對肉牛各飼喂1次，飼喂量為體重的2%。每天早上飼喂前給肉牛提供水、礦物質和維生素，并收集其瘤胃液。瘤胃液經4層紗布過濾后與緩沖液混合，并在39℃下保存。將15 mL的瘤胃液緩沖混合物（2∶1）分配到50 mL的血清瓶中，其中含有0.3 g苜蓿草底物和金銀花提取物（0%、3%、5%、7%和9%）。將血清瓶灌滿無氧氮氣，蓋上橡膠塞，置于搖瓶（120r/min）中39℃孵育48 h。體外試驗采用45個血清瓶（5個處理×3次孵育×3次重復）。

1.2 瘤胃體外發酵特性及其他產生 參考Theodorou等（1994）的研究方法測定氣體產量。采用改進的尼龍袋消解法測定離體干物質降解率。在孵育后，一個帶有基質的尼龍袋在水浴中用以100 r/min洗2次，每次30 min。然后將洗過的尼龍袋60℃烘干至恒重。用血清瓶的重量差來計算干物質降解率。揮發性脂肪酸含量采用高效液相色譜法進行測定，使用添加堿-次氯酸鹽混合培養的苯酚顯色劑對氨氮進行分析。

1.3 微生物豐度分析 微生物PCR引物設計及定量方法參考Denman等（2007）研究方法。

1.4 統計分析 使用SAS統計分析系統軟件，采用常規線性模型程序進行數據分析。通過與對照對照比較，確定金銀花添加水平對培養物pH、干物質降解率、氨氮、揮發性脂肪酸、氣體生成和微生物豐度的影響，并Duncan"s 進行多重比較，確定差異顯著性。用正交多項式對比處理確定線性和二次效應，以評估不同金銀花添加水平的線性和二次曲線效應。所有分析均以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 瘤胃發酵特性 由表1可知，pH值與金銀花添加水平呈正相關。在12 h時，金銀花提取物組較對照組顯著提高了瘤胃氨氮濃度（P＜0.05）。整體來看，5%金銀花提取物組似乎更有價值。

2.2 瘤胃揮發性脂肪酸 由表2可知，在24 h時，隨著金銀花提取物水平的升高，瘤胃總脂肪酸濃度顯著降低（P＜0.05），但乙酸濃度隨金銀花提取物水平的升高表現為顯著升高（P＜0.05），但丙酸濃度隨著金銀花提取物水平的升高在12 h時表現為顯著降低（P＜0.05），乙酸與丙酸比例表現為顯著線性升高（P＜0.05）。

2.3 瘤胃發酵氣體產生 由表3可知，隨著金銀花濃度的升高，氣體總量在瘤胃體外發酵24 h后有升高趨勢（P=0.05），同時，金銀花提取物水平在3%時也有顯著提高瘤胃體外發酵24 h后氣體總量的趨勢（P=0.06）。隨著金銀花提取物水平的升高，甲烷生成量表現為顯著線性降低（P=0.01）。

2.4 瘤胃微生物含量 由圖1可知，對照組微生物表達量均高于其他各組，其中金銀花提取物添加水平為3%時較對照組顯著降低了白色瘤胃球菌的相對表達量（P＜0.05），但對照組與9%金銀花提取物組對白色瘤胃球菌相對表達量的影響差異顯著（P＞0.05）。金銀花提取物組產琥鉑酸絲狀桿菌相對表達量較對照組降低了30%多（P＜0.05），而3%金銀花提取物水平組黃化瘤胃球菌組降低了29%（P＜0.05）。0、3%、5%、7%和9%金銀花提取物組產甲烷菌分別降低45%、26%、44%和29%。

3 討論

瘤胃氨氮濃度是日糧氮向微生物氮轉化效率的粗略預測因子，微生物氮是瘤胃細菌合成的主要氮源。單寧可以降低瘤胃中蛋白質降解和脫氨的速度，降低瘤胃氨氮濃度。氨氮濃度的降低可能是由于部分氨基酸的脫氨基作用減少，或可用性下降造成的氨基酸蛋白質降解，這可能是由于濃縮單寧蛋白復合物的形成，選擇性抑制微生物或酶參與分解代謝的蛋白質。本研究結果發現，孵育24 h后，干物質降解率隨金銀花濃度的增加呈線性下降，這與Tan等（2011）的研究結果一致。

表1 金銀花提取物對瘤胃發酵特性的影響

表2 金銀花提取物對瘤胃揮發性脂肪酸含量的影響

表3 金銀花提取物對瘤胃發酵氣體產生的影響

圖1 金銀花提取物對瘤胃體外發酵12h后細菌表達量的影響

Paengkoum等（2015）發現，添加來自山竹果果皮中的濃縮單寧可以降低乙酸和丙酸的濃度，并增加乙酸與丙酸的值，且隨著濃縮單寧濃度的增加，揮發性脂肪酸總濃度呈線性下降，同時也降低瘤胃發酵速率。本研究結果顯示，添加金銀花提取物在24 h內顯著降低干物質降解率，這反映了其對微生物活性的負面影響。Paengkoum等（2015）研究表明，來自山竹果皮的濃縮單寧降低了氣體總量的產生，并導致氣體產量隨濃縮單寧濃度的增加線性下降。孵育48 h時，隨著金銀花濃度的增加，二氧化碳呈線性下降，作者推測金銀花提取物中的單寧抗產甲烷活性取決于單寧類型和劑量。

濃縮單寧可以抑制瘤胃中主要的纖維分解菌，其抑制程度取決于單寧類型和劑量。但本試驗結果顯示了不同的結果，產甲烷古菌在3%、5%、7%和9%的金銀花提取物組分別減少45%、26%、44%和29%。與其他濃度相比，3%金銀花提取物降低了纖毛蟲數量。金銀花是藥用植物，具有抗菌特性，可能通過消化大量瘤胃細菌而降低微生物蛋白合成。Kim等（2012）用金銀花提取物與瘤胃液孵育的體外試驗和定量PCR分析發現，培養物中纖毛蟲相關的產甲烷菌數量比對照組顯著降低，而纖維分解菌數量增加。其認金銀花提取物含有皂苷、有毒生物堿和單寧等化合物，對細菌有毒害作用。

4 結論

金銀花提取物可以影響體外瘤胃發酵，金銀花提取物可作為一種瘤胃發酵調節劑來抑制甲烷的產生，同時對瘤胃營養物質的消化產生最小的影響。同時它也可以通過抑制產甲烷菌的生長、發育和活性，或通過減少與產甲烷菌相關的原生動物的數量來降低甲烷產生。本試驗結果發現，5%金銀花提取物添加水平顯著降低甲烷排放。