短期超量補充維生素E對熱應激生長豬呼吸性堿中毒和氧化應激的改善作用

吳美芹，孟令凱

（招遠市農業農村局，山東招遠 265400）

熱應激除了降低采食量外，還可直接危害豬的健康狀況，其中熱應激引起的兩種主要疾病是氧化應激和呼吸性堿中毒，這兩種疾病均對豬的健康造成全面危害（李靜等，2005）。在熱應激條件下，豬將血液重新分配到周圍組織，并增加呼吸頻率，以最大限度地散熱。因此，隨著體溫的升高，內臟組織血流量減少，引發豬腸道和骨骼肌氧化應激。氧化應激是自由基和抗氧化能力失衡的結果，它破壞脂質、蛋白質和核苷酸，從而擴大對細胞和器官的功能的影響，特別是氧化蛋白的增加與家畜各種代謝紊亂有關（黃帆和呂秋鳳，2017）。另一方面，過度呼吸會降低血液中的二氧化碳含量，從而引發堿中毒，呼吸性堿中毒可干擾機體各種生化和生理過程，如降低鈣離子濃度，增加乳酸生成（趙久成和公海濤，2016）。因此，減輕豬氧化應激和呼吸性堿中毒對維持豬的健康和生產至關重要，營養劑補充可能為緩解豬氧化應激和呼吸性堿中毒提供一種靈活、經濟的策略。

維生素E是一種脂溶性抗氧化劑，能中和自由基，NRC（2012）建議正常飼養條件下的豬日糧中維生素E含量應達到11 IU/kg。但目前還不清楚豬是否需要更多維生素E來對抗氧化應激。Chauhan等（2014）研究發現，日糧超劑量補充抗氧化物質（100 IU/kg 維生素E+1.2 mg/kg硒）不僅可以減輕氧化應激，還有效改善熱應激條件下羊的呼吸頻率和呼吸性堿中毒，表明短期超量補充抗氧化劑可以有效維持機體酸堿平衡，減輕熱應激介導的氧化應激。因此，本研究旨在探討日糧短期超劑量添加維生素E對熱應激條件下豬氧化還原狀態的影響，確定維生素E在改善呼吸性堿中毒中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與日糧設計 試驗采用2×2因子設計，包括兩種日糧處理和兩種溫度條件。將48頭平均體重為（24±2）kg的生長豬隨機分為2組，每組4個重復，每個重復6頭豬。對照組飼喂基礎日糧（維生素E水平為17.5 IU/kg），處理組在基礎日糧中額外補充維生素E，使維生素E水平達到205 IU/kg。豬只飼喂14 d后，將對照組和處理豬分別置于溫度為20℃、相對濕度45%的條件和溫度為35.5℃、相對濕度為35%～45%的條件下飼養7 d。對照組日糧組成及營養水平見表1。試驗期間，豬只被單獨飼養在帶有金屬網地板的板條箱中。為盡量減少兩個不同溫度組采食量的差異，將采食量限制在20℃條件下豬只自由采食量的75%左右。

表1 日糧原料組成及營養水平

1.2 生理狀況監測 在7 d熱應激期間，每天分別于9點、13點和16點監測豬的呼吸頻率和測定直腸溫度3次。直腸溫度用電子體溫計測量，用秒表在20 s內測定呼吸頻率。

1.3 血液采集及氣體分壓測定 分別在熱應激第7天的9點和15點從頸靜脈采集血樣2次，血液樣品用于測量二氧化碳分壓、氧氣分壓、碳酸氫鹽濃度和pH。血液樣本分裝在肝素鈉和EDTA包被的采血管中，采集0.5 mL白細胞，加入1 ml RNAlater溶液，4℃保存過夜后于-20℃保存。肝素化的血漿樣本保存在-80℃，直到進一步分析氧化應激生物標志物。

1.4 基因表達分析 試驗分析了熱休克蛋白70基因（HSP70）和缺氧誘導因子1α基因（HIF-1α）的表達豐度。引物設計和PCR操作參考Liu等（2018）的方法。

1.5 統計分析 數據分析采用SPSS通用線性模型，以重復為試驗單元。直腸溫度和呼吸頻率試驗數據以溫度×日糧×時間的平均值和標準差表示。血液變量的結果匯總并以溫度×日糧的均值和標準誤差表示，P＜0.05為差異顯著，P＜0.10為有顯著差異趨勢。

2 結果與分析

2.1 采食量和生理狀況 試驗期間通過限制日采食量保證對照組與處理組平均日采食量為（1.46±0.002）kg，平均日采食量不受溫度和日糧處理影響（P＞0.05，數據未列出）。由圖1可知，熱應激使直腸溫度顯著升高（20℃和35℃組分別為38.3℃和39.6℃，P＜0.05）。溫度和時間對直腸溫度的影響具有顯著交互作用（P＜0.05），直腸溫度從9點的38.6℃升高到13點的39.9℃，之后在16點維持在40.1℃。日糧處理對直腸溫度無顯著影響（P＞0.05），同時日糧、溫度和時間對直腸溫度的影響無顯著交互作用（P＞0.05）。

圖1 日糧和溫度對生長豬直腸溫度的影響

由圖2可知，熱應激顯著提高了生長豬呼吸頻率（20℃和35℃為31～124次/min，P＜0.05），溫度與時間之間存在顯著交互作用（P＜0.05），在9～13點呼吸速率由51次/min增加到154次/min，在16點趨于平穩為166次/min，而在20℃時，全天的呼吸頻率維持不變（P＞0.05）。日糧處理對呼吸頻率無顯著影響（P＞0.05），同時日糧、溫度和時間對呼吸頻率的影響無顯著的交互作用（P＞0.05）。

圖2 日糧和溫度對生長豬呼吸頻率的影響

2.2 血液氣體變量 由表2可知，血中二氧化碳分壓由58.7 mmHg顯著下降至46.8 mmHg（P＜0.05），碳酸氫鹽由37.0下降至33.1 mmHg（P＜ 0.05），pH由 7.42上 升 至 7.46（P ＜ 0.05）。溫度對血氧氣分壓無顯著影響（P＜0.05）。日糧維生素E水平對二氧化碳、氧氣分壓、pH和碳酸氫鹽無顯著影響（P＞0.05），但溫度和日糧對血液氣體分壓、碳酸氫鹽和pH的影響具有顯著交互作用（P＜0.05）。在20℃條件下，對照組與處理組對血液氣體分壓、碳酸氫鹽和pH的影響無顯著差異（P＞0.05），但在35℃條件下，與對照組相比，處理組二氧化碳分壓、碳酸氫鹽含量顯著提高（P＜0.05），血液pH顯著降低（P＜0.05）。

2.3 血液氧化應激指標和相關基因表達 由圖3和圖4可知，熱應激顯著增加HSP70基因mRNA豐度（P＜0.05），有提高HIF-1α基因mRNA豐度的趨勢（P=0.08）。

圖3 日糧和溫度對生長豬HSP70基因mRNA豐度的影響

圖4 日糧和溫度對生長豬HIF-1α基因mRNA豐度的影響

由表3可知，溫度和日糧處理對活性氧濃度均無顯著影響（P＞0.05），但溫度和日糧對血漿活性氧濃度的影響具有顯著交互作用（P＜0.05）。熱應激使血漿生物抗氧化物含量2.97 mM顯著降低至2.74 mM（P＜0.05），但日糧處理對該指標無顯著影響（P＞0.05）。熱應激有提高氧化蛋白產物的趨勢（P=0.07），從16.4 μM升高至26.9 μM，但日糧處理對該指標無顯著影響（P＞0.05）。溫度和日糧處理對血漿硫醇基水平均無顯著影響（P＞0.05）。

表2 日糧和溫度對生長豬血液氣體變量的影響

表3 日糧和溫度對生長豬血液氧化應激指標的影響

3 討論

本研究的假設是短期過量補充維生素E（200 IU/kg）可以減輕熱應激對豬的生理反應、呼吸性堿中毒和氧化應激的影響。研究數據表明，本研究使用的維生素E補充劑并沒有減輕豬的氧化應激，但緩解了熱應激誘導的呼吸性堿中毒。熱應激使直腸溫度升高了1.3℃，呼吸速率提高3倍，有利于豬散熱。同時，熱應激使豬呼吸率增加，導致血二氧化碳分壓下降20%，從而降低碳酸氫鹽濃度。盡管如此，正常的血液pH卻無法維持，因為血液pH從7.42增加到7.46，整個過程為典型的呼吸性堿中毒，不能用代謝性酸中毒來補償。Chauhan等（2015）發現，熱應激期間日糧補充抗氧化劑可以使血血液二氧化碳分壓降低50%，阻止血液pH升高，避免血碳酸氫鹽濃度降低，這與本研究結果一致。雖然目前還不清楚高劑量維生素E改善血液中二氧化碳分壓損失的機制，但其效果與改善熱應激綿羊呼吸頻率無關，因為本研究中高劑量維生素E組并沒有降低熱應激豬的呼吸頻率。換句話說，日糧補充維生素E可能對維持血液中二氧化碳濃度有直接作用，從而緩解熱應激引起的呼吸性堿中毒。

血漿中氧化蛋白產物水平的提高可以說明熱應激引起氧化應激。氧化應激的增加可能是由于抗氧化防御系統受損，因為在熱應激期間生物抗氧化物降低9%。氧化應激的增加與熱應激豬體溫升高有關，可以通過白細胞中HSP70 基因mRNA豐度增加證明。但與熱應激水平相似的綿羊不同（Chauhan等，2014），本研究結果的血漿活性氧濃度不受熱應激條件的影響，這表明生物抗氧化物的降低不是由自由基增加引起的，但還應考慮影響抗氧化穩定性的其他因素。飼糧中添加維生素E并不能減輕熱應激組豬的氧化應激，因為無論是生物抗氧化物的降低還是氧化蛋白產物的增加都不能通過添加維生素E得到緩解。本研究補充維生素E的總時間為3周，包括前2周和熱應激1周。Kim等（2015）認為，連續3周補充維生素E足以增強組織維生素E的儲備，補充維生素E（300 IU/kg）2周后，豬血漿和肌肉維生素E濃度達到最大濃度的80%。

本試驗在20℃條件下，補充維生素E的日糧使豬血液中活性氧濃度降低20%，這表明日糧高劑量維生素E在中和正常生理狀態下的自由基方面優于NRC（2012）推薦水平。但在熱應激條件后，高劑量維生素E組和對照組血漿中活性氧濃度的差異減小，但具體機制尚不清楚。我們推測，維生素E、維生素C、谷胱甘肽等抗氧化劑缺乏協同作用，可能限制了維生素E對熱應激豬氧化應激的緩解作用，因為維生素E的重建需要維生素C和谷胱甘肽過氧化物酶的參與（Rooke等，2004）。同樣，在高溫條件下添加125 mg/kg維生素E和0.5 mg/kg硒的肉雞比單獨添加維生素E或硒的肉雞血漿丙二醛濃度降低（Ghazi等，2012）。因此作者認為，下一步應該研究日糧抗氧化物質的組合對熱應激介導的氧化應激的改善作用。

4 結論

綜上所述，在7 d反復熱應激條件下，日糧連續3周補充200 IU/kg的維生素E并不能緩解生長豬的氧化應激。但日糧補充維生素E可以預防熱應激條件下生長豬發生呼吸性堿中毒。