藿香正氣水調節小鼠腸道菌群失調的作用研究

1.四川省甘孜藏族自治州人民醫院消化內科， 四川 康定 62600;2.成都中醫藥大學附屬醫院，四川 成都 61105

人腸道菌群數量龐大，正常情況下，腸道菌群和宿主、外界環境建立起一個動態的生態平衡，對人體的健康起著重要作用，任何打破其內外環境的舉措都可導致菌群失調，表現為腸道菌群的種類、數量、比例、定位和代謝特征的變化[1]。機體內的菌群生態平衡遭到破壞后可引起二重感染或重疊感染，使機體的生態平衡遭到嚴重破壞，從而引發腹瀉、腹脹等臨床癥狀。臨床上菌群失調多見于大劑量使用抗生素和慢性消耗性疾病，部分中藥及中成藥具有扶植正常菌群生產的作用，可調節菌群失調，從而達到治療或改善臨床癥狀的作用[2-5]。本院有大量采用藿香正氣水治療菌群失調型腹瀉的臨床案例，為探討其作用機制，筆者設計本實驗以觀察其對菌群失調的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級昆明種小鼠60只，雌雄各半，體重18～22 g。由四川省中醫科學院實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(川)2013-19，飼養溫度18～22℃，相對濕度58%～62%，喂食顆粒標準飼料，自由飲水和攝食，每2天更換1次墊料，正常飼養3d后供試，實驗前小鼠飲水、進食正常，狀態良好。

1.2 藥品與試劑 乳酶生片(批號160408，桂林南藥股份有限公司)；鹽酸林可霉素針劑(批號160611，天津金耀氨基酸有限公司)；藿香正氣水(160607，太極集團有限公司)；Anaero Gen 2.5 litre(英國Oxoid)；瓊脂粉、牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏(廣東環凱生物科技有限公司)；L-半胱氨酸(上海伯奧生物科技有限公司)；伊紅美蘭培養基(EMB)、改良MRS培養基、改良MC培養基、EC培養基；其余試劑均為分析純。

2 試驗方法

2.1 鹽酸林可霉素誘導小鼠腸道菌群失調模型的建立[6-8]造模前對小鼠禁食不禁水12 h，然后灌胃0.30 g/mL鹽酸林可霉素，0.6 mL/次(小鼠每克體重給藥7.2 mg)，2次/d，連續5d，造成小鼠菌群失調。正常對照組給予同體積的生理鹽水。于末次給藥12 h后取小鼠新鮮糞便進行細菌數檢測，觀察造模情況。與正常對照組比較，若球菌和桿菌數量變化顯著，則認為造模成功。

2.2 分組及處理 取造模成功的小鼠50只隨機分為藿香正氣水高劑量組、藿香正氣水中劑量組、藿香正氣水低劑量組、乳酶生組和模型組，每組10只，分別給予灌胃 3.0 mL·kg-1、1.5 mL·kg-1、0.75 mL·kg-1的藿香正氣水溶液，0.132 mg·g-1乳酶生片，均用生理鹽水補足到相同給藥體積(0.2 mL/20 g)，2次/d，連續給藥7 d。模型對照組、正常對照組小鼠灌胃同體積的生理鹽水。于末次給藥12 h后取小鼠的新鮮糞便進行細菌數檢測。

2.3 糞便的菌群檢測[8]于末次給藥12 h后通過按壓小鼠腹部的方式迫使小鼠排便，收集約1 g的新鮮糞便，置帶有玻璃珠的無菌小瓶中，以1∶10(W/V)比例加入無菌生理鹽水，震蕩均勻，作為第一稀釋濃度。然后用生理鹽水連續10倍稀釋至10-7。選用10-6、10-7兩個濃度的供試液，取10 μL均勻涂布于EMB、EC、MRS、MC平板上。EMB、EC于37℃需氧培養24h，MRS、MC厭氧培養48～72h后觀察結果。根據菌落特征以及革蘭氏染色結果初步鑒定菌種，并統計菌落數。結果以每克糞便中菌落數的對數表示(lgCFU·g-1)。

3 實驗結果

3.1 小鼠腸道菌群失調模型建立 小鼠連續給予鹽酸林可霉素3 d后，開始出現腹瀉、精神萎靡、扎堆等現象，連續給藥5 d后，收集小鼠新鮮糞便，檢測其細菌變化。由表1可知，模型組小鼠腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌、乳酸菌的含量均降低，與正常對照組比較，腸球菌、雙歧桿菌含量減低，具有統計學意義(P<0.05)；腸桿菌、乳酸菌含量明顯減低，差異具有顯著統計學意義(P<0.01)。

表1 小鼠腸道菌群失調模型建立后小鼠糞便的細菌含量變化

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與正常對照組比較，**P<0.01。

3.2 藿香正氣水對腸道菌群失調模型小鼠細菌含量的影響 菌群失調模型小鼠通過乳酶生和不同劑量藿香正氣水處理后，其腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌和乳桿菌含量均顯著上升，與模型組比較差異具有統計學意義(P<0.05)，與正常對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。由表2可知，灌胃鹽酸林可霉素可制造穩定的菌群失調小鼠模型，造模成功后，模型組小鼠給予生理鹽水治療，其腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌和乳桿菌的含量分別為(7.48±0.35) lgCFU·g-1、(8.27±0.37) lgCFU·g-1、(8.14±0.28) lgCFU·g-1、(7.22±0.27) lgCFU·g-1，與正常對照組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)，尤其是腸桿菌和乳桿菌(P<0.01)。藿香正氣水能顯著升高腸道菌群失調模型小鼠糞便中腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌、乳桿菌的含量。藿香正氣水低劑量組(0.75 g/kg)與模型組比較，腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌和乳桿菌含量均有所升高，但除乳桿菌外，差異均無統計學意義(P>0.05)。藿香正氣水中劑量組(1.5 g/kg)與模型組比較，腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌含量明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)，乳桿菌含量升高最為明顯，差異均有顯著統計學意義(P<0.01)。藿香正氣水高劑量組(3.0 g/kg)與模型組比較，腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌和乳桿菌含量明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表2 小鼠糞便標本的菌群檢測結果

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與正常對照組比較，**P<0.01。

4 討論

目前抗菌藥物是最常見引起腸道菌群失調的誘因，抗菌藥物使用后將腸道內敏感細菌大量殺死，各菌種間的比例發生較大幅度的變化而超出正常范圍的狀態，特別是原籍菌的數量和密度下降，而外籍菌的數量和密度升高。抗菌藥物所致的腸道菌群失調的主要臨床癥狀為腹瀉，本實驗應用鹽酸林可霉素灌胃造模后小鼠新鮮糞便的菌落數量和種類均明顯下降，且給藥3 d開始出現腹瀉癥狀，隨后出現精神萎靡、食欲不振等癥狀，表明通過此法所制作的腸道菌群失調小鼠模型是可靠的，實驗結果可信[9-10]。

多數細菌在同一環境中生存，相互間會形成生物拮抗，避免某一種細菌(特別是致病菌或條件致病菌)成為優勢菌，最終對機體產生不良反應，如：嘔吐、腹瀉等臨床癥狀[7]。藿香正氣水主要由藿香、蒼術、陳皮、厚樸、白芷、茯苓、半夏、甘草、紫蘇等多味中藥組成，具有散寒化濕、和中祛暑的作用，常用于治療脘腹脹痛、嘔吐腹瀉以及胃腸感冒等。在臨床實踐中，發現其對腸道菌群失調型腹瀉亦具有良好療效，為發掘其治病機理，遂設計本實驗，以期能初步揭示其治療腸道菌群失調型腹瀉的方式以及物質基礎。在本實驗中，藿香正氣水中、高劑量組均能顯著改善鹽酸林可霉素所致的腸道菌群失調癥狀，扶植腸道菌群，恢復腸道健康，表明藿香正氣水具有一定調節腸道菌群失調的作用。