金銀花種子質量檢驗方法與分級標準研究△

王書云，袁王俊，劉亞芳，李書敏，劉麗君，李夢煥，李欽*

1.河南大學 藥學院/河南省高校杜仲工程研究中心，河南 開封 475004；2.哈爾濱醫科大學 藥化教研室/省部共建生物醫藥工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150081

忍冬LonicerajaponicaThunb.是忍冬科Caprifoliaceae忍冬屬多年生藤本植物[1]，其干燥花蕾或初開的花入藥為金銀花，有“中藥中的抗生素”之稱，廣泛用于治療各種疾病，包括關節炎、糖尿病、發熱、感染、疼痛和腫脹等，主要化學成分有：有機酸、黃酮、氨基酸、核苷酸和醇類等[2-4]。除藥用外，金銀花也被廣泛應用于食品、化妝品及保健品等行業。

金銀花為我國40種常用大宗藥材品種之一，種質資源豐富，河南、河北、山東等地均有大量栽培，但習慣認為山東產量最大，而河南品質最佳[5]。金銀花一年開3～4茬花，合理的栽培技術對金銀花產量有較大影響。目前，金銀花種植主要以莖枝扦插為主，扦插繁殖可縮短進入豐產期的年限，但長期使用易致種質退化，而用種子繁育幼苗適應性強、易馴化，對長距離引種及良種選育具有重要應用價值[6]。研究發現金銀花種子有較強的休眠特性，自然條件下不經處理發芽率極低[7]，限制了種子繁育的生產和規模化應用。課題組前期研究發現金銀花種子的休眠機制，并找到快速解除休眠的方法，為種子繁育技術在金銀花種植及品種培育中的廣泛應用提供可靠依據。

良好的種質資源是種苗繁育的基本保障，但不同來源的金銀花種子質量差異懸殊，對金銀花種子育苗的廣泛應用有很大程度的影響。目前對金銀花種子的研究主要集中在種子特性、休眠機制及提高萌發率等方面[7-10]，未見種子質量等級研究的相關報道，本課題組收集了全國主產區的20份金銀花種子，開展了金銀花種子質量檢測方法和質量分級標準研究，初步制訂了金銀花種子的質量分級標準和等級評定方法，為行業或國家標準的制定提供依據。

1 材料

1.1 樣品

用于質量檢驗方法研究的種子，于2017年10月底采自新鄉市封丘縣東仲宮村金銀花GAP種植基地。用于質量標準研究的種子，于2017年10月采自金銀花主產區(河南、山東、河北三省8個縣)，共20份，樣品具體信息見表1。所用種子均為采集的全成熟金銀花果實經反復揉搓果肉，用水沖洗，紗布過濾，水沉去除漂浮在水面上的種子，剩余種子取出、陰涼處晾干，經河南大學藥學院袁王俊副教授鑒定為金銀花L.japonicaThunb.的種子。

1.2 儀器

SMZ-161-BLED體式顯微鏡(麥克奧迪實業集團有限公司)，BSA224S電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)，BPH-9082恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)，粉碎機(GR150A，合肥榮事達小家電有限公司)。

1.3 種子質量檢驗方法研究

1.3.1 種子真實性鑒定 隨機取適量健康飽滿的金銀花種子，先肉眼觀察種子顏色、形態、大小及表面特征，再用體式顯微鏡仔細觀察其性狀特征并拍照記錄，并用鏡臺測微尺測量種子的長、寬、厚度，記錄并計算平均值和范圍[11]。

1.3.2 扦樣 參照《中國農作物種子檢驗規程》(GB/T 3543.2-1995)“農作物種子檢驗規程——扦樣”，用“四分法”扦取樣品。凈度分析樣品取樣量應≥2500粒種子，送檢樣品量為凈度分析樣品量的10倍。

1.3.3 凈度分析 扦取的樣品過18目篩，去除小顆粒雜質及果皮，然后放在凈度工作臺上，分開凈種子、廢種子、果皮和果柄、泥沙以及其他雜質，分別稱質量，平行重復3次，計算凈度，公式如下：

種子凈度=凈種子/(凈種子+廢種子+果皮與果柄+泥沙及其他)×100%

(1)

1.3.4 千粒質量測定 按照百粒法、五百粒法和千粒法3種方法來測定種子的質量。Ⅰ百粒法：隨機取100粒凈種子，稱質量，平行重復6次；Ⅱ五百粒法：隨機取500粒凈種子，稱質量，平行重復6次；Ⅲ千粒法：隨機取1000粒凈種子，稱質量，平行重復3次。根據稱量結果，計算出標準差及變異系數，測定值的重復間變異系數<4.0%有效。

1.3.5 水分測定 用低溫恒溫烘干法和高溫恒溫烘干法2種方法測定種子。隨機取4份凈種子，每份約2 g，其中2份直接放入潔凈干燥的稱量瓶中，剩余2份分別粉碎后放入潔凈干燥的稱量瓶中。分別將稱量瓶放置在(105±2)℃(低溫恒溫烘干法)、(130±2)℃(高溫恒溫烘干法)恒溫烘箱，間隔1 h取出，真空干燥器中冷卻至室溫后稱質量，直至連續2次稱質量差不超過0.02 g。測定時樣品暴露在空氣中的時間應<2 min，稱量并記錄質量變化，重復3次，含水量計算公式如下：

種子含水量=(烘干前供試樣質量-烘干后供試樣質量)/烘干前供試樣質量×100%

(2)

1.3.6 胚率測定 隨機取凈種子100粒，于水中浸泡12 h，用解剖刀沿種子脊部兩側的凹溝切開，觀察其胚，重復3次，按公式(3)計算。

胚率=有胚種子數/供試種子數×100%

(3)

1.3.7 生活力測定 隨機取凈種子50粒，于25 ℃浸泡種子6 h，沿胚的中軸線將種子切成兩半，用不同濃度的TTC溶液35 ℃避光染色，TTC濃度：0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.7%，染色后1、2、3、4、5、6、12、24 h，分別記錄生活力，以沸水煮過之后種子為空白對照，重復3次，按公式(4)計算。

生活力=有生活力總胚數/供試種子數×100%

(4)

1.3.8 相對電導率測定 隨機稱取凈種子0.5、1.0、1.5 g，分別用蒸餾水和雙蒸水沖洗3遍，浸泡在50 mL雙蒸水中，于25 ℃恒溫箱中，分別測定初始電導率記為：a1，浸泡2、4、8、12、24、32 h時的電導率記為：a2，將種子和浸泡液煮沸30 min后冷卻至室溫的電導率記為：a3，重復3次，按公式(5)計算相對電導率。

相對電導率=(a2-a1)/(a3-a1)×100%

(5)

1.3.9 發芽試驗 隨機取凈種子100粒，室外沙藏75 d后取出，于25 ℃恒溫培養箱中培養，統計種子發芽率，種子以種皮開裂，胚根凸出為萌發標準。

發芽率=20 d內全部發芽種子數/供試種子數×100%

(6)

1.4 種子分級標準研究

依據上述金銀花種子質量的檢驗方法，分別對種子的凈度、千粒質量、含水量、胚率、生命活力、相對電導率、發芽率7個指標進行測定。采用SPSS 19.0統計分析軟件對測得數據進行相關性分析、主成分分析和K-均值聚類分析。

2 結果與分析

2.1 真實性鑒定

金銀花種子近橢圓形或三角狀卵形，稍扁，種子長1.7～4.0 mm，寬1.0～3.0 mm，厚0.5～2.0 mm。頂端稍圓，基部稍尖，表面灰褐色或褐色，種皮革制，種子背面中部有凸起的脊，脊兩側有2條明顯的凹溝，腹面脊不明顯，種臍位于極軸一端(圖1)。

注：A為種子背面；B為種子腹面。圖1 體視顯微鏡下金銀花種子表面特征圖

2.2 扦樣

采用“四分法”扦取金銀花種子試樣，種子凈度分析試驗所需試樣質量不少于8.4 g(不少于2500粒種子)，送檢樣品質量不少于為84.0 g。

2.3 凈度分析

金銀花種子凈度分析結果見表2，3次平行重復金銀花種子的增失差均未偏離原始質量的5%，因此，該方法和程序準確可靠。

表2 金銀花種子凈度分析

表3 金銀花種子千粒質量測定

2.4 千粒質量測定

千粒質量測定結果見表3，百粒法、五百粒法、千粒法變異系數分別為1.56%、1.18%、0.88%，均未超過4.0%，所以百粒法、五百粒法、千粒法均可用于金銀花種子的質量測定。為減少實際工作量，以百粒法作為種子千粒質量的測定方法。

2.5 水分測定

不同方法測定的種子水分結果見表4，單因素方差分析結果顯示，種子整粒低溫恒溫(105±2)℃、整粒高溫恒溫(130±2)℃均在烘干3 h后水分含量無顯著變化，粉碎低溫恒溫(105±2)℃烘干2 h后無顯著變化，粉碎高溫恒溫(130±2)℃烘干1 h后水分含量變化不顯著，并且4種方法測定的結果無顯著性差異，綜合考慮實驗操作的便捷性及穩定性，確定以整粒低溫恒溫(105±2)℃烘干3 h作為金銀花種子含水量的測定方法。

2.6 胚率測定

沒有胚或胚發育不成熟的種子基本不會萌發，種子的胚率及成熟胚是保證種子萌發的基本條件，因此測定種子胚率對于評定種子的質量來說十分重要。金銀花種子胚率測試結果發現，胚率達到91%，基本滿足萌發需要。

2.7 TTC染色法測定種子生命活力

2.7.1 生活力鑒定標準 根據TTC染色法的原理與染色結果(見圖2)，確定種子有無生命活力的標準如下：符合下列染色情況之一的列為有生活力的種子：1)種胚全部為紅色，胚頂端顏色偏深的，如圖2A；2)胚軸為淡紅色，胚頂端或胚兩端為深紅色，如圖2B、2C；3)整體染色較淺，如圖2D；符合下列染色情況之一的列為無生活力的種子：1)胚軸為淺粉色，胚頂和胚兩端為白色，如圖2E；2)胚全部為白色，如圖2F。

表4 不同烘干時間金銀花種子水分測定

注：不同大寫字母表示同一列數據間差異具有統計學意義，不同小寫字母表示同一行數據間差異具有統計學意義，下同。

2.7.2 生命活力測定結果 不同TTC濃度、染色時間、(35±1)℃的恒溫培養箱中測定的種子生命活力結果見表5。各濃度正常染色5 h后，染色種子數量均無顯著增加，用沸水煮過的種子無法正常染色。0.1%、0.2%和0.3% TTC濃度之間染色結果均存在顯著性差異，其中0.3% TTC染色效果最好；而0.3%、0.5%、0.7% TTC濃度之間染色結果均無顯著性差異，因此，3種染色濃度均可采用。為節約成本，故確定金銀花種子生命活力的測定方法：(35±1)℃恒溫培養箱中0.3% TTC染色5 h。

表5 不同染色時間TTC染色法測定金銀花種子生命活力

2.8 相對電導率測定

種子相對電導率測定結果見表6。結果顯示，相對電導率隨浸泡時間的增加而增大；0.5、1.0、1.5 g種子浸泡24 h后相對電導率與32 h無顯著差異；0.5、1.0、1.5 g種子浸泡24 h的相對電導率變異系數分別為1.80%、1.30%和2.20%。故確定將1.0 g種子在50 mL雙蒸水中浸泡24 h后測定相對電導率。

注：A～D.有生命活力的胚；E～F.無生命活力的胚。圖2 金銀花種胚TTC染色圖

表6 不同浸泡時間金銀花種子相對電導率測定結果

2.9 發芽試驗

課題組前期對金銀花種子休眠機制和快速解除休眠方法進行系統研究，本研究采用將種子于4 ℃條件下低溫層積75 d后，25 ℃光照恒溫培養箱中紙床培養測定萌發率，以種皮開裂，胚根凸出為萌發標準；首次計數為置床后第7天，末次計數為第20 d，以20 d內全部種子發芽數計算萌發率。

2.10 種子質量檢驗方法

本研究從凈度、千粒質量、含水量、胚率、生命活力、相對電導率、發芽率試驗7個指標對金銀花種子質量進行研究，最終確定適用于金銀花種子質量的檢驗方法，見表7。

表7 金銀花種子質量檢驗方法

2.11 種子分級標準

2.11.1 種子質量檢測結果 運用表7所示的金銀花種子質量檢驗方法，測定從主產區收集的20份種子的凈度、千粒質量、含水量、胚率、生活力、相對導電率、發芽率7個質量指標，結果見表8。

表8 20份不同來源的金銀花種子質量分析結果(n=20)

2.11.2 分級指標的確定

2.11.2.1 相關性分析 20份種子質量指標的相關性分析結果見表9。結果顯示：胚率與生命活力、相對電導率、發芽率顯著相關，r為0.774、-0.435、0.425；發芽率與胚率、生命活力、相對電導率顯著相關，r為0.425、0.440、-0.610，故胚率、生命活力和相對電導率均能在一定程度上反應種子的活力，表征種子的發芽潛能，可用于種子質量快速檢驗。

2.11.2.2 主成分分析 根據20份種子的質量檢驗結果進行主成分分析，計算出各主成分的特征向量和貢獻率，并根據向量的絕對值將不同質量指標劃分到不同的主成分之中，結果見表10。主成分因子1、2、3特征值均大于1，累計貢獻率達到78.97%，有很強的代表性，因此采用這3個主成分因子對金銀花種子質量進行評價。決定第一主成分大小的主要是胚率、生命活力、含水量和發芽率4個指標，其中胚率的特征向量高達0.892，是金銀花種子分級的最主要指標。第二主成分大小的決定性因素是相對電導率和千粒質量，其值為0.955。決定第三主成分大小的主要是凈度，其值為0.909。在相關性分析和主成分分析結果的基礎上，結合生產實踐經驗和檢驗的可操作性，擬定凈度、千粒質量、含水量、胚率和發芽率5個指標作為質量分級的指標。

表10 各質量檢驗指標的特征值及貢獻率

注：*指標在各因子中的最大值；—表示指標對該因子基本無影響。

2.11.2 質量分級標準及評定方法 采用SPSS 19.0分析軟件對20批金銀花種子凈度、千粒質量、含水量、胚率和發芽率5個指標進行K-均值聚類分析，將種子質量分為3個等級，其余為不合格。綜合指標K聚類分析結果見表11，最終制定的金銀花種子質量分級標準見表12。具體等級評定方法如下：根據表12種子凈度、千粒質量、含水量、胚率、發芽率和性狀特征進行單項指標的定級，Ⅲ級以下定為等外。6項指標均在表12同一質量級別時，直接定級；6項指標有1項在Ⅲ級以下，定為等外；若不在同一級別，按低的級別定級。

表11 綜合指標K聚類分析結果

表9 20份不同來源的金銀花種子質量檢測指標間的相關性分析

注：*P<0.05，**P<0.01。

表12 金銀花種子質量分級標準

3 結論與討論

本課題組開展了金銀花種子質量檢驗方法的研究，并對不同來源的金銀花種子質量指標進行檢驗，通過相關性分析、主成分分析和K-均值聚類分析，確定以凈度、千粒質量、含水量、胚率、發芽率和性狀特征6項指標初步制定金銀花種子質量分級標準和具體等級評定方法。

主成分分析篩選出胚率、生命活力、含水量、發芽率、千粒質量、凈度和相對電導率對金銀花種子質量影響較大，而我們最終選擇了凈度、千粒質量、含水量、胚率、發芽率和性狀特征作為質量分級的標準。雖然數據分析時未對種子的性狀特征進行統計分析，但性狀特征是種子交易時最直觀的重要參考，因此，最終把性狀特征作為種子質量標準的依據之一。發芽率直接反映種子在田間的出苗率，以其為最重要的質量指標與生產需求相符合[12]。本實驗中發芽率也是最重要的指標，其特征向量絕對值為0.662。主成分分析支持生命活力作為金銀花種子質量的重要依據，本文通過TTC染色法檢測種子的生命活力，多數情況下，生命活力與發芽率有高度相關性，但檢測結果發現有數份種子生命活力較高，但發芽率不高。金銀花種子雖有休眠特性，但種子成熟后通過GA3處理，可解除休眠(課題組前期研究結果)，20 d內發芽率就可完成檢查，因此，最終選擇了直接檢測發芽率而放棄生命活力作為金銀花種子質量標準的依據。