響應面法優化山蠟梅葉顆粒總黃酮提取工藝△

黃平，毛坤軍*，金賢武，張莉，毛文成

1.江西醫學高等專科學校，江西 上饒 334000；2.上饒市食品藥品檢驗檢測中心，江西 上饒 334000；3.上饒縣人民醫院，江西 上饒 334100

山蠟梅葉顆粒具有辛涼解表、清熱解毒之功效[1]，主要用于風熱感冒、發熱、惡寒和咽痛等癥狀，臨床上常用于小兒手足口病、呼吸道感染、小兒外感發熱等疾病的治療[2-4]。據報道，山蠟梅葉中主要活性成分為黃酮、生物堿、香豆素等化學成分[5]。其中黃酮類化合物含量最多，且具有抗炎、抗肝纖維化、抗菌和解痙攣等多種藥理作用，是中藥及其制劑質量控制的主要指標成分[6-10]。目前，僅有學者建立了山蠟梅葉顆粒中2個有效成分槲皮素和山柰素的含量測定方法[11]，還未見關于山蠟梅葉顆粒總黃酮相關研究的報道。

響應面法是通過擬合不同因素與響應值之間的函數關系，尋求最佳工藝參數，達到最終優化工藝的目的[12-13]。因此，為進一步提高山蠟梅葉顆粒的質量控制方法，本實驗在單因素的基礎上，采用響應面法對山蠟梅葉顆粒中總黃酮的工藝進行優化，以獲得提取率高的工藝條件，為山蠟梅葉顆粒質量標準的進一步完善提供參考。

1 材料

UV-2600型紫外分光光度計(日本島津公司)；KQ-500DE 型數控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；FA2004B 型萬分之一電子天平(上海佑科儀器儀表公司)。

山蠟梅葉顆粒購自江西佑美制藥有限公司(批號分別為：180302、1701011、1703016、1803022)。蘆丁對照品(批號：100080-200905)購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結果

2.1 含量測定方法

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取對照品蘆丁5.0 mg，置于 50 mL定量瓶中，加甲醇制得0.1 mg mL-1的對照品溶液。

2.1.2 標準曲線的繪制 分別精密吸取2.1.1項下對照品溶液0、1、2、3、4、5 mL，分別置于25 mL量瓶中，按質量標準方法制備標準曲線[1]。得回歸方程Y=18.16X-0.002，r=0.999 5，表明在0.004～0.02 mg mL-1內具有良好線性關系。

2.1.3 供試品溶液的制備 取山臘梅葉顆粒，按設定的條件進行提取，搖勻定容，得供試品溶液。

2.1.4 樣品中總黃酮的含量測定 精密量取2 mL供試品溶液，置于25 mL容量瓶中，按2.1.2項方法測定吸光度，計算總黃酮得率。

2.2 響應面法優化山臘梅葉顆粒總黃酮提取工藝

2.2.1 單因素考察

2.2.1.1 乙醇濃度的考察 稱取山臘梅葉顆粒1.0 g，平行3 份，考察乙醇濃度對山臘梅葉顆粒中黃酮化合物得率的影響。由圖1可知，乙醇濃度在40%～50%時，隨著乙醇濃度的加大，黃酮得率逐漸升高；乙醇濃度超過50% 后，黃酮得率反而隨著濃度的加大而降低。因此，乙醇濃度以50%左右較為適宜。

圖1 不同濃度乙醇對山臘梅葉顆粒總黃酮得率的影響

2.2.1.2 液料比的考察 稱取山臘梅葉顆粒1.0 g，平行3 份，考察液料比對山臘梅葉顆粒中黃酮化合物得率的影響。由圖 2 可知，液料比在10∶1至40∶1時，隨著液料比的加大，黃酮得率逐漸升高；液料比超過40∶1后，黃酮得率反而隨著液料比的加大而降低。因此，液料比以40∶1 左右較為適宜。

圖2 不同液料比對山臘梅葉顆粒總黃酮得率的影響

2.2.1.3 提取時間的考察 稱取山臘梅葉顆粒1.0 g，平行3 份，考察提取時間的對山臘梅葉顆粒中黃酮化合物得率的影響。由圖 3 可知，提取時間在60 min時，黃酮得率最高；提取時間的超過60 min后，黃酮得率反而隨著提取時間的延長而降低。因此，提取時間以60 min左右較為適宜。

圖3 不同提取時間對山臘梅葉顆粒總黃酮得率的影響

2.2.2 響應值結果及其擬合模型 以總黃酮得率為響應值，進行響應面分析，以乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取時間(C)3個因素為自變量，以總黃酮得率為響應值進行實驗設計，各因素水平設計見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平

2.2.3 響應面試驗設計 根據星點設計方法原理，利用Design-Expert 8.0 Trial 軟件設計三因素三水平共17個試驗，每個試驗重復3次，山臘梅葉顆粒Box-Behnken中心組合試驗設計和結果見表2。

2.2.4 模型擬合及顯著性分析 利用軟件對表2中數據進行擬合分析，得山蠟梅葉顆粒總黃酮得率對A、B、C的回歸方程：Y=0.44+0.007 75A+0.009 625B-0.000 125C-0.002AB+0.011AC-0.000 75BC-0.036A--0.024B2-0.023C2。

表2 響應面設計與結果

表3 響應面模型方差分析結果

2.2.5 響應曲面分析 由回歸模型系數顯著性檢驗結果可以看出，模型一次項中 A1(乙醇濃度)、B2(液料比)和C3(提取時間)均不顯著；二次項A1B2、B2C3和 A1C3影響也均不顯著，但A12、B22和 C32均影響顯著，其中A12為極顯著。由此可見，各影響因素對黃酮類化合物得率的影響不是簡單的線性關系。在所選取的各因素水平范圍內，按照對結果的影響排序，乙醇濃度>液料比>提取時間。乙醇濃度與提取時間的交互作用對黃酮化合物得率的影響最大，其次為乙醇濃度與液料比的交互作用，液料比與提取時間的交互作用最不顯著。

2.2.6 工藝優化與預測 響應面圖是響應值在各試驗因素交互作用下得到的結果，可以預測和檢驗變量的響應值以及確定變量的相互關系[14]。根據回歸方程作出模型的響應曲面及等高線(圖4～6)。由圖可知隨著A、B、C取值增大，總黃酮得率增加，達到最大值后，隨著各因變量的增大，響應值反而下降。運用Design Expert 8.06統計軟件解析回歸方程，以總黃酮得率為參考指標，得到山蠟梅葉顆粒總黃酮提取的最佳工藝參數為：乙醇濃度52.06%，液料比41.97∶1，提取時間為60.60 min。在此最優工藝條件下總黃酮提取率可達0.447%。

圖4 乙醇濃度與液料比對黃酮得率的響應面圖和等高線圖

圖5 乙醇濃度與提取時間對黃酮得率的響應面圖和等高線圖

圖6 液料比與提取時間對黃酮得率的響應面圖和等高線圖

2.2.7 驗證實驗 綜合以上提取工藝及實際情況考慮，修正提取工藝為：乙醇濃度52%，液料比42∶1，提取時間為60 min。在此條件下，3次平行實驗得到的山蠟梅葉顆粒總黃酮實際平均提取率為0.453%，與理論預測值0.447%相差0.006%。說明此方案是可行的，優化所得的提取條件具有實際應用價值。

3 討論

黃酮類化合物是山蠟梅的主要活性成分，具有抗炎、抗病毒、鎮咳、抗過敏、解痙、降血脂等方面的作用，本研究以山蠟梅葉顆粒為原料，采用超聲提取法，在單因素試驗的基礎上，對山蠟梅葉顆粒總黃酮提取工藝參數進行條件優化。結果所得最佳提取條件為：乙醇濃度52%，液料比42∶1，提取時間為60 min，對山蠟梅葉顆粒質量標準的制定具有重要的指導意義，有利于中藥配方顆粒的進一步發展。