Box-Behnken響應面法優(yōu)化野菊花多糖的提取工藝及其抗氧化活性研究△

梁艷妮，李歡歡，唐志書，張東博，雷莉妍，王征

陜西中醫(yī)藥大學 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心/陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712083

野菊花為菊科植物野菊GhrysanthemumindicumL.的干燥頭狀花序，清熱解毒、瀉火平肝，臨床用于疔瘡癰腫、目赤腫痛、頭痛眩暈[1]。野菊花含萜類成分較多，主要存在于揮發(fā)油中；黃酮類化合物是其重要的藥效成分[2-3]，具有廣譜抗菌、抗病毒、降壓、增加冠脈血流量、抑制血小板聚集、抗炎、抗氧化等作用[4]。中藥多糖具有抗氧化、抗腫瘤、促進免疫等藥理活性[4-5]。目前國內(nèi)對野菊花、野菊莖葉多糖的提取分離純化工藝[6-9]、含量測定[10]、脫色工藝、結構鑒定及活性[11]均有研究。李厚兵等[8]優(yōu)化了野菊花多糖的大孔吸附樹脂純化工藝，陸穎等[9]采用大孔吸附樹脂LSA-21脫色處理，再經(jīng)DEAE-52 纖維素柱和Sephadex G75 凝膠色譜分離純化得3個均一野菊花多糖。膜分離技術以選擇性透過膜為分離介質(zhì)，以電位差、濃度差或壓差為推動力，從而實現(xiàn)對特定組分的分離、提純和濃縮。膜分離技術以其高效、節(jié)能、無二次污染、低成本、高選擇性等優(yōu)點被廣泛應用于各個領域，可用于中藥提取液的除雜、分離純化、濃縮等方面[12-15]。目前已經(jīng)應用膜分離技術對枸杞多糖[16]、六味地黃糖類[17]、沙棗多糖[18]、馬尾藻多糖[19]等多糖類成分進行了分離純化，效果良好。與均勻設計與正交設計相比，Box-Behnken響應面法采用多元二次回歸方程擬合各因素與響應值之間的函數(shù)關系，具有試驗次數(shù)少，精度高，預測性好的優(yōu)點[20-22]。本文采用水提醇沉法，選取料液比、提取時間及提取溫度3個因素，在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken Design(BBD)優(yōu)化野菊花多糖的提取工藝，采用膜分離純化后評價野菊花多糖的體外抗氧化活性，為野菊花多糖開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1儀器

HH-2恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；KQ-300DE數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；GB204 電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；FA2004B萬分之一電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；VaCo5低溫冷凍干燥儀(智拓科技控股有限公司)；FE-1000AD固體粉碎機(天津鑫博得儀器有限公司)；UV-2600紫外分光光度計(日本島津制作所)；LNG-CM-101膜分離設備(上海朗級膜分離設備工程有限公司)。

1.2 試藥

無水D-葡萄糖對照品(批號：110833-201205，純度：95%～98%)，購自中國食品藥品檢定研究院；所用試劑均為分析純。

野菊花(批號：110801，產(chǎn)地陜西)為菊科植物野菊GhrysanthemumindicumL.的干燥頭狀花序，購自陜西興盛德藥業(yè)，由陜西中醫(yī)藥大學王繼濤高級實驗師鑒定。

2 方法與結果

2.1 多糖的測定

參照鄧寒霜等[20]的多糖含量測定方法，采用苯酚-硫酸法測定野菊花中多糖的含量。精密稱取無水葡萄糖對照品適量于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容制得200 μg mL-1的葡萄糖對照品溶液。依次精密量取此對照品溶液1、2、3、4、5、6 mL于10 mL容量瓶中，加水定容。分別精密量取各質(zhì)量濃度對照品溶液0.6 mL，加入5%苯酚溶液1.2 mL，并迅速加入4 mL濃硫酸，搖勻后置于沸水浴中保溫30 min，取出后冷卻至室溫，以蒸餾水為空白對照，測定490 nm處吸光度。以多糖濃度為橫坐標(X)，吸光度值為縱坐標(Y)制作標準曲線，得線性方程Y=6.43X+0.035 7(r=0.998 7)，線性范圍為20～120 μg mL-1。

2.2 多糖的提取

2.2.1 工藝流程 將野菊花干品粉碎成粗粉，用10倍體積石油醚回流脫脂3次，每次1.5 h，常溫干燥。稱取10 g脫脂野菊花置于圓底燒瓶中，按一定料液比，浸提溫度和浸提時間熱水提取2次，冷卻濾過，合并上清并濃縮后加入4倍量80%乙醇靜置過夜，所得沉淀依次用無水乙醇、丙酮洗滌后加適量蒸餾水復溶，冷凍干燥得野菊花多糖。

2.2.2 多糖提取率的計算 將水提醇沉得到的多糖冷凍干燥，精確稱取樣品多糖 10 mg，定容至100 mL，搖勻，即得樣品供試液；精確吸取供試液 1 mL置于10 mL試管中，根據(jù)2.1項下操作于490 nm 處測定 A 值，通過回歸方程計算樣品中多糖濃度。按式(1)計算多糖提取率。

提取率=[(多糖濃度×樣品體積×定容體積)]/原料干質(zhì)量×100%

(1)

2.3 單因素試驗

參照2.2.1項工藝流程，每次稱取10 g脫脂野菊花干燥粉末，進行單因素試驗，分別考察料液比(1∶16、1∶20、1∶24、1∶28、1∶32 g mL-1)、提取時間(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h)和提取溫度(60、70、80、90、100 ℃)對野菊花多糖提取率的影響。

2.3.1 料液比對野菊花多糖提取率的影響 在固定提取溫度90 ℃，提取時間3.0 h時，考察不同料液比1∶16、1∶20、1∶24、1∶28、1∶32 g mL-1對野菊花多糖提取率的影響，結果見圖1。從圖1可以看出，野菊花多糖提取率呈先升高后降低的趨勢，當料液比為1∶24時，野菊花多糖提取率最大，此時野菊花多糖提取率為2.91%，在溶劑量較小時多糖溶解不完全，而在溶劑量較大時會導致其他雜質(zhì)的溶解。因此將料液比為1∶20、1∶24、1∶28 g mL-1作為響應面優(yōu)化試驗的水平。

圖1 料液比對多糖提取率的影響

2.3.2 提取時間對野菊花多糖提取率的影響 在固定提取溫度90 ℃，料液比1∶24 g mL-1時，分別考察提取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h對野菊花多糖提取率的影響(見圖2)。圖2中野菊花多糖提取率呈先升高后降低的趨勢，當提取時間為2.5 h時，野菊花多糖提取率最大，此時野菊花多糖提取率為3.01%，提取時間較短時多糖溶解可能不完全，而在提取時間較長時多糖的結構被破壞。因此提取時間為2.0、2.5、3.0 h作為響應面優(yōu)化試驗的水平。

圖2 提取時間對多糖提取率的影響

2.3.3 提取溫度對野菊花多糖提取率的影響 在固定料液比1∶24 g mL-1，提取時間2.5 h時，分別考察60、70、80、90、100 ℃對野菊花多糖得率的影響(見圖3)。圖3中野菊花多糖提取率呈先升高后降低的趨勢，當提取溫度為90 ℃時，野菊花多糖提取率最大，此時野菊花多糖提取率為3.01%，在提取溫度的過低時可能導致多糖溶解不完全，而在提取溫度較高時導致多糖的結構被破壞和部分多糖被水解。因此提取溫度為80、90、100 ℃作為響應面優(yōu)化試驗的水平。

圖3 提取溫度對多糖提取率的影響

2.4 響應面優(yōu)化試驗

2.4.1 Box-Behnken設計與分析 根據(jù)單因素試驗結果分別以料液比(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)為自變量，以多糖提取率為響應值，利用Design-Expert.V8.0.6中Box-Behnken模型設計試驗組作響應面分析。Box-Behnken試驗設計因素水平表見表1，試驗設計與結果見表2，方差分析見表3。

通過Design-Expert.V8.0.6得到3個因素：料液比、提取溫度和提取時間對野菊花多糖得率影響的二次多項回歸方程為Y=3.22+0.12A+0.064B+0.31C-0.21AB-0.40AC+0.074BC-0.29A2-0.79B2-0.68C2。表3中該回歸模型P=0.003 8<0.01差異有統(tǒng)計學意義，失擬項P=0.906 1>0.05，差異無統(tǒng)計學意義，表明該模型擬合度好，試驗誤差小，能夠準確反映3個因素對野菊花多糖提取率的影響。表3中一次項C和交互項AC的P<0.05，表明提取溫度和料液比的交互作用對多糖得率的影響差異有統(tǒng)計學意義；二次項B2和C2的P<0.01，表明提取溫度和提取時間的平方項對多糖得率的影響差異有統(tǒng)計學意義。比較各項F值可知各因素對響應值的影響大小為C>A>B，即提取溫度>料液比>提取時間。

表1 Box-Behnken試驗設計因素水平表

表2 Box-Behnken試驗設計與結果

表3 響應面回歸模型方差分析

注：**P<0.01；*P<0.05。

2.4.2 響應面圖分析與優(yōu)化 通過多元回歸方程作三維效應曲面圖和二維平面等高線圖，從圖4～6可以直觀分析3個因素之間的交互作用以及對多糖提取率的影響。由等高線可知，AB、AC交互作用顯著(等高線橢圓狀)，BC交互作用不顯著(等高線圓形)。由響應面可看出，提取溫度對多糖的提取率的影響顯著，響應面陡峭；而料液比與提取時間對多糖的提取率的影響不顯著，響應面較平緩。

圖4 料液比與提取時間對野菊花多糖提取率的交互影響

圖5 料液比與提取溫度對野菊花多糖提取率的交互影響

圖6 提取時間與提取溫度對野菊花多糖提取率的交互影響

2.4.3 驗證實驗 根據(jù)響應面分析優(yōu)選得到水提醇沉野菊花多糖的最佳工藝：料液比為1∶25 g mL-1，92.3 ℃下提取2.5 h，野菊花多糖的理論提取率為3.25%。驗證上述工藝條件得到野菊花多糖提取率為(3.18±0.07)%，n=3，表明本文優(yōu)化得到的野菊花多糖最佳提取條件穩(wěn)定，工藝可靠。

2.5 野菊花多糖的分離純化

2.5.1 Sevage法脫蛋白試驗 取1 g多糖粗粉，溶解成100 mL多糖溶液，在多糖溶液中加入三氯甲烷20 mL，然后加入正丁醇4 mL，置于水浴恒溫振蕩器，37 ℃，240 r min-1劇烈振搖20 min，離心，取上清液。醇沉，抽濾，冷凍干燥得野菊花多糖。

采用考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質(zhì)含量：精密稱取牛血清蛋白10 mg，用水定容至10 mL容量瓶中，即為對照品溶液。精密移取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8 mL的蛋白質(zhì)對照品溶液于8只試管中，加水補至1 mL，搖勻。然后各取0.1 mL溶液于10 mL容量瓶中，再分別加入5 mL考馬斯亮藍顯色液，搖勻，放置2 min，測定595 nm下吸光度。以濃度為橫坐標(X)，吸光度為縱坐標(Y)擬合得到線性方程：Y=0.004 6X+0.005 6(r=0.999 5)，線性范圍為10～80 μg mL-1。取0.5 mL的多糖稀釋液，同法顯色后測吸光度值A，代入線性方程計算脫蛋白前后多糖中的蛋白質(zhì)量濃度，按公式(2)計算蛋白質(zhì)脫除率，公式(3)計算多糖保留率：Sevage法蛋白質(zhì)脫除率為23.58%，多糖保留率為63.97%，多糖損失較小。

蛋白質(zhì)去除率=(c1-c2)/c1×100%

(2)

式中c1、c2分別為脫蛋白前后蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，c1=71.7 μg mL-1，c2= 54.8 μg mL-1。

多糖保留率=mj/mi×100%

(3)

式中mi、mj分別為脫蛋白前后多糖的質(zhì)量濃度，mj=639.7 mg mL-1，mi=10 mg mL-1。

2.5.2 過氧化氫法脫色素試驗 取1 g多糖粗粉，溶解成100 mL多糖溶液，加入30%H2O2溶液10 mL，10%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0后，55 ℃水浴不斷攪拌1 h，加熱除去H2O2，冷卻至室溫，醇沉，抽濾，冷凍干燥得野菊花多糖。通過公式(4)計算多糖脫色率，公式(5)計算多糖保留率。

脫色率=(Ai- Aj)/Ai×100%

(4)

式中Ai、Aj分別為脫色前后的吸光度，Ai= 0.778，Aj= 0.302。

多糖保留率=mj/mi×100%

(5)

式中mi、mj分別為脫色前后多糖的質(zhì)量濃度，mj=296.5 mg mL-1，mi=10 mg mL-1。

比較脫色前后吸光度得過氧化氫法脫色率為61.18%，多糖保留率為29.65%。過氧化氫法脫色素效果明顯，但多糖損失較多。

2.5.3 膜分離純化試驗 將野菊花粗多糖配制成10 mg mL-1的多糖水溶液，壓力恒定，分別過0.8、0.2 μm陶瓷膜得截留液和滲透液，測試膜分離所得截留液和滲透液的多糖含量及多糖純度。當膜孔徑由0.8 μm變?yōu)?.2 μm時，野菊花多糖損失率至少為70%，按公式(6)計算；野菊花多糖溶液的顏色由黃褐色變成淺黃色；滲透液顏色淺于截留液顏色，且截留液野菊花多糖含量比滲透液多糖含糖量高；0.8 μm滲透液中野菊花多糖回收率與純度均高于0.2 μm滲透液，表明野菊花中多糖分子直徑多大于0.2 μm。

多糖損失率=(mi-mj)/mi×100%

(6)

式中mi、mj分別為過膜前后多糖的質(zhì)量濃度，mi=10 mg mL-1，mj(0.8 μm)=6.32 mg mL-1，mj(0.2 μm)=2.19 mg mL-1。

2.6 抗氧化活性測定

將0.8 μm陶瓷膜純化后的野菊花多糖作抗氧化活性測定。

2.6.1 DPPH 清除活性 按照陳智坤等[23]清除DPPH 的方法，向6支試管中分別加入 2 mL 6 mmol L-1的 DPPH 乙醇溶液和2 mL質(zhì)量濃度分別為1、2、4、6、8、10 mg mL-1的野菊花多糖溶液，充分混合，室溫避光反應 30 min后在 517 nm 測吸光度Ax；將多糖溶液換以等體積的無水乙醇同上測定吸光度A0；將DPPH 乙醇溶液換以等體積的無水乙醇，加入不同濃度的野菊花多糖溶液，同上測定吸光度Ay。以上測定均作3組重復樣取平均值，清除率按計算公式(7)計算。

清除率=[1-(Ax-Ay)/A0]×100%

(7)

從圖7可看出野菊花多糖對DPPH 的清除率隨著濃度增大而增強，在1～10 mg mL-1有量效關系，多糖濃度為10 mg mL-1時清除率達90.15%。

圖7 不同濃度野菊花多糖對DPPH· 的清除作用

2.6.2 · OH清除活性 以水楊酸法測定對 · OH[14]的清除能力，在試管中分別依次加入 6 mmol L-1FeSO4溶液2 mL，質(zhì)量濃度分別為1、2、4、6、8、10 mg mL-1的野菊花多糖溶液2 mL，6 mmol L-1H2O2溶液2 mL，混勻反應10 min，分別加入6 mmol L-1水楊酸溶液2 mL，混勻37 ℃反應20 min后測定510 nm下吸光度Ax；將水楊酸乙醇溶液換以水測定吸光度 Ay，將多糖溶液換以水測定吸光度A0，以上樣品均重復3次取平均值，清除率計算公式為：

· OH清除率=[1-(Ax-Ay)/A0]×100%

(8)

從圖8可看出野菊花多糖對 · OH的清除率隨著濃度增大而增強，在1～10 mg mL-1有量效關系，多糖質(zhì)量濃度為10 mg mL-1時清除率達78.26%。

圖8 不同濃度野菊花多糖對· OH的清除作用

3 討論

響應面法通過合理的試驗設計進行有限次試驗，利用所得結果采用多元二次回歸方程擬合多因素與響應值的函數(shù)關系，可以快速確定最優(yōu)工藝參數(shù)[24-25]。本文首先通過單因素試驗確定因素水平，采用Box-Behnken法設計試驗優(yōu)化野菊花多糖的水提醇沉前處理條件，建立的二次回歸方程擬合度好，能夠合理反映水提取料液比、提取溫度和時間對野菊花多糖得率的影響。利用此模型得到的野菊花多糖的最佳提取工藝為料液比1∶25 g mL-1，92.3 ℃提取2.5 h，多糖提取率為3.25%。由驗證實驗可知，理論預測值與試驗值接近，結果可靠。黃家利等[26]采用正交設計法優(yōu)化得到的最佳工藝條件為提取溫度90 ℃，料液比1∶20 g mL-1，提取時間4 h，多糖得率為3.32%。本文所得最佳工藝更經(jīng)濟，效應面法三維圖使多因素對考察指標的影響更為直觀。

對野菊花粗多糖的純化處理表明：Sevage 法脫蛋白的脫除率為23.58%，過氧化氫法除色素的脫色率為61.18%，0.8 μm陶瓷膜對多糖除雜效果明顯。膜分離純化后的野菊花多糖對DPPH 和 · OH的清除具有濃度依賴性，多糖質(zhì)量濃度在10 mg mL-1時對DPPH 的清除率可達90%，對 · OH的清除率可達78%，野菊花多糖的強抗氧化性為其進一步的開發(fā)提供了理論依據(jù)。