江枳殼HPLC指紋圖譜及標志性成分含量測定研究△

孔慶國，張凱月，張曄，呂金朋，丁成健，李志成，張輝*

1.吉林省醫療器械檢驗所，吉林 長春 130062；2.長春中醫藥大學，吉林 長春 130117

枳殼是蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實。枳殼性苦、辛、酸，溫，具有理氣寬中、行滯消脹的功效[1]，主治胸脅氣滯、脹滿疼痛、食積不化、痰飲內停、胃下垂、脫肛、子宮脫垂等病癥。目前枳殼在我國長江流域及其以南各省區均有栽培[2]，主要產地有江蘇、浙江、江西、臺灣、湖北、湖南、廣東、廣西、四川、云南等省份，形成了多種來源的中藥枳殼商品藥材[3]，但同時也造成了臨床用藥混亂的局面。枳殼以湖南和江西的產品為佳。其中江西省新干的枳殼又名商州枳殼、三湖枳殼，具有“果肉厚，外翻如覆盆，瓤瓣數較多”的特點，其藥用的有效成分優于其他品種[4]，簡稱江枳殼。江枳殼中有大量的揮發油，目前已能進行含量測定的揮發油有50多種，主要有效成分為檸檬烯、蒎烯、蒎烯芳樟醇等，另外，還含有黃酮及生物堿類成分，主要的黃酮類成分有柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、川陳皮素、紅橘素等。主要的生物堿成分有辛弗林(synephrine)、酪胺(tyramine)、N-甲基酪胺(N-methytyramine)、喹諾林(qinoline)等[5]。本研究對不同批次江枳殼的指紋圖譜進行比較并結合測定有效成分含量為江枳殼的質量控制提供了量化數據，同時為江枳殼的規范化種植提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

800A型多功能粉碎機(永康市紅太陽機電有限公司)；BS110S型電子天平(美國雙杰兄弟有限公司)；1100型Agilent高效液相色譜儀(美國Aglient儀器公司)；KQ3200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；WP-UP-10型精密型實驗室專用超純水機(上海捷惠科學儀器有限公司)；LXJ-IIB型低速大容量多管離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1.2 試藥

枳殼標準藥材(批號：120981-201104)、蕓香柚皮苷(批號：110721-201316)、柚皮苷(批號：111857-201102)、橙皮苷(批號：110722-201312)、新橙皮苷對照品(批號：10736-200628)購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇(分析純，北京化工廠)；甲酸(色譜純，ANAQUA Chemicals)；乙腈(色譜純，Fisher Chemicals)；水為娃哈哈純凈水。枳殼采自江西九江，共10批次，經長春中醫藥大學張輝教授鑒定為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.的干燥未成熟果實。

1.3 結果分析軟件

中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A版功能：通過導入相關液相色譜圖，使用設參照譜、多點校正、自動匹配[8]、生成對照等功能對需要的色譜圖進行比對分析，可以得到這一批色譜圖的相似度等信息。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

取枳殼藥材，粉碎，精密稱取1.0 g，置100 mL具塞錐形瓶中，選擇加甲醇30 mL，密塞，超聲處理30 min，取出放冷，用濾紙濾過，藥渣連同濾紙放回錐形瓶中再加甲醇30 mL，超聲處理30 min，放冷，用濾紙濾過[9]，合并兩次濾液，蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉移至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，既得。

2.2 對照品溶液的制備

取蕓香柚皮苷、柚皮苷，橙皮苷、新橙皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL各含80 μg的溶液，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱：kromasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫：35 ℃；檢測波長為254 nm；流速為0.8 mL min-1。以乙腈為流動相A，以0.1%的甲酸溶液為流動相B按程序梯度洗脫(0～10 min，0%～5%A；10～15 min，5%～15%A；15～40 min，15%～35%A；40～70 min，35%～55%)；進樣10 μL。色譜圖見圖1～3。

注：3.蕓香柚皮苷；4.橙皮苷；5.新橙皮苷；6.柚皮苷。圖1 江枳殼HPLC圖

注：3.蕓香柚皮苷；4.橙皮苷；5.新橙皮苷；6.柚皮苷。圖2 枳殼對照藥材HPLC圖

注：1.蕓香柚皮苷；2.橙皮苷；3.新橙皮苷；4.柚皮苷。圖3 對照品HPLC圖

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 任意選取一個按照2.2下方法制備的對照品溶液，按2.3項下方法連續進樣5次。相對保留時間的RSD為0.086%～0.808%，相對峰面積的RSD為1.901%～2.741%，表明方法的精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 按照2.1下方法制備同一供試品溶液5份，按2.3下的液相條件進樣，相對保留時間的RSD值為0.097%～1.991%，相對峰面積的RSD值為0.777%～2.866%，表明方法重復性良好。

2.4.3 穩定性試驗 按照2.1下方法制備供試品溶液，按2.3下色譜條件分別于第0、4、12、24、48 h進樣，相對保留時間的RSD值為0.001%～0.011%，相對峰面積的RSD值為2.558%～2.928%，說明樣品至少在48 h內穩定。

2.5 指紋圖譜的建立

利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件(2004A)對11批枳殼藥材(S1～S10為江枳殼藥材，S11為枳殼對照藥材)共計11批樣品的高效液相色譜圖進行分析比較[10]，以探究其呈現的具有“指紋”意義的共有峰的相對保留時間、相對保留峰面積、相似度等數據。指紋圖譜的建立是為江枳殼的質量控制提供科學依據。在11批枳殼樣品的高效液相色譜圖的基礎上[11]，通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A版的軟件，可建立該樣品的高效液相色譜指紋圖譜。

注：3.蕓香柚皮苷；4.橙皮苷；5.新橙皮苷；6.柚皮苷；S1～S10.江枳殼；S11.枳殼對照藥材；R.對照譜圖。圖4 11批枳殼的高效液相色譜指紋圖譜(λ=254 nm)

2.6 枳殼的高效液相色譜圖分析

枳殼的高效液相色譜可分離出10余個成分。經中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A版軟件的對比，從中選取8個具有“指紋”意義和穩定的共有峰。見表1。

2.7 共有峰的相對保留時間及相對峰面積

通過與對照品保留時間進行比較，峰3為蕓香柚皮，峰4為橙皮苷，峰5為新橙皮苷，峰6為柚皮苷。橙皮苷在本實驗條件下實現了最佳的吸收度和較好的分離度，峰位居中，相對面積穩定，故將橙皮苷色譜峰定為參照峰。計算各共有峰的相對保留時間及相對保留峰面積，見表2～3。

表1 11批枳殼8個共有峰峰面積

表2 11批枳殼的8個共有峰的相對峰面積

表3 11批枳殼的8個共有峰的相對保留時間

2.8 指紋圖譜相似度計算

參照“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A版”軟件計算得到11批枳殼樣品的高效液相色譜指紋圖譜的相似度[12-16]，見表4。

表4 11批枳殼的相似度

從表4可以看出，本實驗中11批枳殼樣品的高效液相指紋圖譜的相似度均在0.900以上，可初步判定這11批枳殼樣品的高效液相指紋圖譜相似。

2.9 枳殼中橙皮苷及柚皮苷的含量測定

2.9.1 線性關系考察 以2.2項下方法制成對照品溶液，分別吸取2、4、6、8、10 μL進樣，按2.3色譜條件測定。以峰面積為Y軸，進行線性回歸分析，得到橙皮苷回歸方程：Y=776.13X+119.27(r=0.999 7)，橙皮苷線性范圍0.479～2.395 μg，柚皮苷回歸方程Y=840.91X+98.98(r=0.999 2)，柚皮苷線性范圍0.500 4～2.394 μg。

2.9.2 精密度試驗 分別精密吸取混合對照品溶液10 μL，在2.3項色譜條件下重復進樣5次，計算橙皮苷、柚皮苷的峰面積RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.9.3 穩定性試驗 精密吸取同一個按照2.1方法制備供試品溶液，分別于0、2、6、12、18、24 h進樣。結果顯示，各色譜峰面積的RSD均小于2.0%。

2.9.4 重復性試驗 精密吸取同一個按照2.1方法制備供試品溶液，在2.3項色譜條件下重復進樣5次，各色譜峰的峰面積RSD均小于2.0%，表明方法的重復性良好。

2.9.5 加樣回收試驗 取已知含量的枳殼樣品約1 g，平行6份，精密稱定分別加入對照品適量，按2.1方法制備供試品溶液，按2.3項色譜條件下進行分析，計算橙皮苷、柚皮苷的平均加樣回收率分別為98.95%、99.67%。

2.9.6 樣品含量測定 按照2.1方法制備11批供試品溶液，按2.3項色譜條件下分別測定橙皮苷、柚皮苷的的含量，含量測定結果見表5。

表5 江枳殼樣品中橙皮苷與柚皮苷含量測定 %

3 結論

枳殼的有效成分因其產地、氣候、采收時間、加工方法及品種不同有很大的差異[17-20]。本實驗利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件”對11批枳殼藥材建立HPLC指紋圖譜，結果表明11批枳殼樣品具有比較好的重復性和穩定性，相似度均在90%以上，符合《中華人民共和國藥典》要求。同時測定了11批枳殼樣品中橙皮苷和柚皮苷的含量，結果顯示不同樣品中兩種成分的含量差異不大。實驗結果表明，江西九江的10批江枳殼藥材無明顯差異。通過對指紋圖譜的相似度分析，結合主要成分的含量測定結果，發現這種聯合的方法特征性及專屬性強，是枳殼質量控制的一種有效、合理的方法，也可為其他傳統中藥的質量評價提供參考。