白藜蘆醇對卵巢癌增殖、遷移和侵襲的影響及可能機制

李 可，康 玉，陳 行*

（復旦大學附屬婦產科醫院婦科，上海 200011）

目前，卵巢癌的主要治療方式為手術聯合鉑類、紫杉醇等一線化療，雖然患者獲得比較滿意的近期療效，但5年生存率仍然徘徊在30%～40%[1]。白藜蘆醇是一類廣泛存在與植物中的多酚類物質，具有抗炎、抗氧化甚至抗腫瘤的活性[2-3]。近年來，白藜蘆醇的抗腫瘤作用在多個癌種中被驗證，但是白藜蘆醇對卵巢癌的抑制及其機制還不清楚。本研究擬采用多種人上皮性卵巢癌細胞系，研究白藜蘆醇對卵巢癌的抑制作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

人上皮性卵巢癌:SKOV3,OVCAR3,OVCAR5,OVCA R8,CAOV3,ES2細胞由上海市腫瘤所惠贈。白藜蘆醇購自Sigma-Aldrich公司(R5010純度≥98%)；CCK8（Cell Counting Kit-8）試劑購自日本同仁公司（CK-04）。培養基RPMI-1640、DMSO、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；BCA蛋白試劑定量盒(美國Pierce公司)；β-ACTIN和GAPDH多克隆抗體美國Cell signaling Technology公司；Nrf2抗體購自英國Abcam公司（ab137550）；CO2培養箱和多功能酶標儀均購自美國Thermo Scientific公司;倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 實驗方法

將購買的人卵巢癌細胞解凍復蘇后，制成細胞懸浮液，接種于相應的培養基中(10%胎牛血清，100 U／ml青霉素，100 mg／ml鏈霉素)，常規培養于37℃，5%二氧化碳細胞培養箱，予以換液1～2天/次，顯微鏡下觀察，待細胞長至對數生長期時用0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化后傳代。

1.3 數據統計

所有實驗重復至少三次。采用SPSS 20.0對數據進行統計分析。采用one-way ANOVA對多組間樣本均數進行比較，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。采用GraphPad Prism 6.0軟件進行作圖分析。計量資料記錄方式為均數±標準差(Mean±SD)，P＜0.05為有統計學意義(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)。

2 結 果

2.1 不同濃度白藜蘆醇對卵巢癌細胞增殖情況的影響

選擇四種卵巢癌細胞系，將對照組（僅培養液）的細胞活性設置為100%，與對照組相比，白藜蘆醇（不同濃度梯度）處理后，卵巢癌細胞的活性逐漸降低，且呈藥物濃度依賴性，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 白藜蘆醇處理不同卵巢癌細胞后細胞的凋亡情況

采用Annexin V-FITC/PI細胞凋亡技術，與對照組（僅DMSO）相比，白藜蘆醇處理組凋亡顯著，且呈時間依賴性，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 白藜蘆醇處理卵巢癌細胞后Nrf2基因水平的表達

利用PCR檢測白藜蘆醇處理卵巢癌細胞系后Nrf2在mRNA水平上的表達，結果顯示，與對照組相比（僅培養液），加入白藜蘆醇后Nrf2表達升高。

2.4 白藜蘆醇處理卵巢癌細胞后Nrf2蛋白水平的表達

Western blot檢測結果表明，與對照組比較，使用白藜蘆醇處理卵巢癌細胞系24和48小時后，Nrf2蛋白表達增強。經統計分析發現，與對照組Nrf2蛋白表達相比，白藜蘆醇處理卵巢癌細胞24和48小時后的Nrf2蛋白表達增強均有統計學意義（P＜0.05）。

3 討 論

卵巢癌因其發病隱匿、診斷多為晚期且較易耐藥復發，是死亡率位居首位的婦科惡性腫瘤。其不斷增殖和失巢凋亡的特性，其致死率居高不下，因此，探究抑制卵巢癌的增殖和失巢凋亡的藥物，是抑制卵巢癌進展，提高生存率的關鍵。目前，大量研究表明白藜蘆醇可誘導多種腫瘤細胞凋亡、抑制多種腫瘤細胞增殖的作用。

白藜蘆醇是1940年首次發現的植物提取化合物，因其具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等多種生物活性，近幾年引起眾多研究人員的重視。Jang等首次提出白藜蘆醇具有抗癌活性，其能夠通過多條途徑調節癌細胞的增殖、凋亡、遷移和血管生成，且具有極低的毒性及副作用。本研究表明，白藜蘆醇組多種卵巢癌細胞的增殖能力顯著低于對照組，且細胞凋亡率顯著高于對照組，且差異均有統計學差異，提示白藜蘆醇能夠抑制卵巢癌細胞的增殖能力，并能夠誘導卵巢癌細胞凋亡。

為進一步探索白藜蘆醇抑制卵巢癌增殖和誘導凋亡的作用機制，我們通過檢索大量文獻發現，白藜蘆醇具有激活核轉錄相關因子2(Nrf2)的作用，而Nrf2的激活障礙與癌癥進展有著密切相關性。本研究表明，白藜蘆醇組Nrf2表達水平無論是在mRNA水平水平還是蛋白水平，均表達增加，提示白藜蘆醇能夠通過上調Nrf2表達水平抑制卵巢癌細胞的增殖，誘導卵巢癌細胞凋亡。

綜上所述，目前盡管國內外學者在白藜蘆醇抗女性生殖系統惡性腫瘤方面的研究已經取得一定的進展，但針對其具體作用機制的研究還不是十分深入。由于白藜蘆醇可以對多種女性生殖系統惡性腫瘤起到抑制生長促進凋亡的作用，再加上其無毒副作用的優勢，因此有望成為新一代的抗腫瘤藥物。