利用鑭系金屬探針的順磁及發光特性研究蛋白質相互作用

吳 桐

（浙江外國語學院科學技術學院，浙江 杭州 310023）

在細胞信號傳導、細胞遷移、基因表達等多項生理活動中，都會發生蛋白質相互作用。所以在生命科學研究中，需要對蛋白質相互作用進行深入研究。但從實踐情況來看，采用傳統核磁共振、熒光檢測等技術進行蛋白質相互作用觀察，容易遭遇蛋白質標記問題，需要借助鑭系金屬探針特性加強蛋白質標記，從而得到科學的研究結果。

1 鑭系金屬探針的順磁及發光特性

作為稀土元素，鑭系金屬中的釓元素帶有顯著的順磁特性，鋱元素則具有較好發光特性。釓離子擁有半充滿f軌道和各向同性g張量，自旋量子數較大，同時擁有較長弛豫時間[1]。利用順磁探針提供的未配對電子與核間相互作用，可以加快弛豫速率，同時不會引起交叉相干弛豫，能夠提供簡單的數據分析過程。借助溶液核磁共振技術，能夠使釓的順磁弛豫得到增強，從而對蛋白質復合體進行標記。在核磁共振實驗中，順磁弛豫增強的大小與電子和核間距離成正比關系，電子擁有較大磁矩，能夠實現長距離監測，因此能夠用于研究蛋白質相互作用。鋱的發射譜在可見光區域內，熒光壽命達毫秒級。采用熒光波譜學技術，可以實現時間延遲檢測，將納秒量級背景熒光去除，從而使鋱成為發光探針對蛋白質特異性進行標記，使熒光技術在蛋白質特異性檢測上的不足得到彌補[2]。針對分子量較大的蛋白質，采用核磁共振等技術難以實現結構解析。利用鋱探針進行蛋白質標記，能夠對蛋白質結構、裝配和動態變化進行分析，因此可以實現蛋白質相互作用的研究。

2 利用鑭系金屬探針研究蛋白質相互作用

（1）利用釓探針研究蛋白質相互作用。在對蛋白質相互作用展開研究時，利用釓探針順磁特性，通過增強順磁弛豫能夠提供距離信息約束，實現蛋白質結構系綜優化精修，對生物大分子復合體瞬時構象進行觀測，確定蛋白質間發生的相互作用。采用該方法，能夠獲得較之電子質子更短的基態結構，得到低分布頻率構象，因此能夠對蛋白質相互作用進行動態研究。在研究大腸桿菌磷酸轉移系統時，細胞信號傳導需要通過蛋白質磷酸化作用實現。但是從生物信息學角度來看，在數以萬計蛋白質間，僅幾千個蛋白質復合體能夠獲得原子水平分辨率結構信息，其中能夠實現信號傳導的則更少。針對蛋白質復合體擁有較高分辨率結構信息的特征，需要采用釓探針實現核磁共振實驗中順磁弛豫增強，對弱相互作用遭遇的蛋白質復合體進行檢測，從而得到相應結構信息。

實驗需要以大腸桿菌基因為模版實現定點突變，利用非同位素進行蛋白表達純化，然后實現核磁共振滴定。在整個過程中，酶I（EI）C末端結構域內，需要對磷酸烯醇式丙酮酸的水解作用進行催化，促使其N端結構域（EIN）實現自動磷酸化，將基團傳遞至組氨酸磷酸運載蛋白，最終傳遞至酶IIA（EIIA）。研究EI與EIIA間發生的相互作用，可以進行二者間核磁共振滴定實驗，利用釓探針在EIIA突變體和D144C突變體中進行釓離子的引入。通過研究發現，EI和EIIA間平衡解離常數約13mM，說明二者之間存在較弱相互作用，能夠證明EI和EIIA間并非直接相互作用。通過對磷酸化酶促反應進行測定可以發現，EIIA能夠被EI直接磷酸化，缺失突變體的酶則會對這一過程進行抑制，因此可以說明Hpr酶未參與到磷酸化過程中。在實驗期間，能夠檢測發現EI-EIIA復合體的存在，但是存在時間和比例均較少。由此可見在蛋白質間發生極弱相互作用時會對復合體進行遭遇，但在各種因素調節下能夠達到結合與解離間的平衡，保證細胞信號順利傳播。

（2）利用鋱探針研究蛋白質相互作用。實際上，細胞中各種生理活動需要利用不同信號通路實現，各通路之間會發生交叉對話。蛋白質作為細胞信號傳導網絡的節點，需要通過相互作用實現信號傳遞。采用熒光技術，可以利用熒光分子間能量轉移現象進行蛋白質相互作用研究，即根據熒光分子發射光譜和受體間光譜重疊情況確定距離約束信息，對蛋白質動態學信息進行獲取。但是由于生物樣本自發熒光，采用有機小分子探針對蛋白質進行標記會出現非特異性問題。采用鋱探針，可以通過電子自旋禁阻軌道躍遷發光，只有較小的發光系數，能夠利用有機生色基團進行能量轉移，在紫外激發下發出綠光，從而通過扣除納秒級熒光壽命實現蛋白質特異性檢測。在活細胞中，利用有色氨酸的結合標簽，能夠使鋱離子與目的蛋白質融合。標簽中的天冬氨酸等可以與鋱離子構成穩定配位化學鍵，實現蛋白質的特異性標記。

在研究半胱氨酰白三烯受體CysLTR時，可以在基因中不同位點進行結合標簽突變質粒的插入，利用數據庫對氨基酸序列展開分析。由于其是細胞膜外N末端進行的多次跨膜蛋白，通過插入結合標簽，能夠使N末端和膜外loop環對鋱離子進行結合，實現受體標記。利用標記的hCysLTR對轉染細胞進行刺激，可以借助標記物中激動劑白三烯D4實現，然后對細胞內鈣增高情況進行測定。從研究結果來看，利用含結合標簽的質粒進行細胞轉染后，相較于野生型受體，得到的受體不會出現細胞內鈣增高的情況。在結合標簽與hCysLTR之間進行甘氨酸的插入，能夠實現柔性鏈接。從細胞內鈣的檢測結果來看，依然無反應，可知增加柔性鏈接長度無法產生刺激作用。由于鋱的激發波段為紫外，不利于生物樣本觀察，因此可以引入喹諾酮，采用更長波長實現激發。

采用光學顯微鏡成像法進行觀測，可以發現鋱離子對細胞形態和活性不會產生顯著影響。利用多光子顯微鏡進行鋱標記的蛋白觀察，可以發現標記的蛋白質和未標記的蛋白質都發出了微弱熒光，與細胞自發背景熒光被激發有關。對微妙延遲檢測時間進行設置可以發現，未插入結合標簽的蛋白質熒光完全消失，但是利用鋱標記特異性蛋白質依然發光。由此可見，在膜外loop區蛋白質標記檢測方面，可以采用鋱探針對蛋白質相互作用進行研究。采用該方法，利用多功能酶標儀進行細胞觀察，可以發現鋱離子對蛋白質做出的特異性標記。

3 結論

通過研究可以發現，在蛋白質相互作用研究領域，采用傳統的熒光檢測技術和核磁共振技術容易遭遇蛋白質標記問題。而對鑭系金屬探針進行運用，能夠借助釓探針順磁特性和鋱探針發光特性實現蛋白質特異性標記，為研究蛋白質相互作用提供支持。因此在實踐工作中，還應加強鑭系金屬探針特性分析，以便實現探針合理利用，滿足蛋白質相互作用研究需求。