黃芪多糖通過Traf6/TAK1 信號通路調節視網膜神經節細胞的炎癥反應

賴莉，覃暉

黃芪多糖（Astragalus polysaccharide，AP）是來源于黃芪的一種活性物質，并且表現出廣泛的藥理活性，包括抗氧化應激、參與免疫調節、調節血糖水平及抗炎等方面[1-2]。有研究發現黃芪多糖能夠抑制過氧化氫誘導的大鼠視網膜神經節細胞（RGC-5）凋亡，對RGC-5 細胞的氧化應激損傷具有保護作用[3]。然而對體外培養的視網膜神經節細胞是否具有抗炎保護作用不明確。青光眼的發病原因較為復雜，由多因素引起的一類退行性、致盲性視神經病變[4]。臨床主要表現為視神經萎縮、視野損傷、視網膜神經節細胞凋亡等[5]，在導致視力喪失的眼病中位居第2位[6]，嚴重影響著患者的正常生活和健康。視神經的損傷會進一步導致視網膜神經節細胞（RGCs）內發生炎性損傷，引起視網膜神經節細胞原發或繼發死亡。因此，本文采用體外培養RGCs 細胞構建炎性細胞模型，探討黃芪多糖對脂多糖誘導的RGC-5 細胞炎性反應的保護作用，并初步研究其可能作用的機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

視網膜神經節細胞（RGC-5，武漢巴菲爾生物有限公司）；黃芪多糖（陜西中鑫生物有限公司，批號：1203011）；DMEM 培養基（上海谷歌生物有限公司）、胰蛋白酶（美國Sigma 公司）；CCK-8 試劑盒購自默沙克生物科技有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海谷歌生物有限公司，批號P0012S-07）；IL-6、TNF-α 檢測試劑盒購自上海華美生物有限公司；一抗稀釋液（上海吉諾公司，批號：C154855）；ECL 顯 色 液（Sigma 公 司）；β-actin、Traf6、TAK1 及p-TAK1 一抗（均購自美國Cell Signaling Technology）；二抗羊抗兔IgG 購自美國LI-COR Biosciences。單人超凈工作臺（北京六一儀器廠）；CB15C02 型細胞培養箱（北京六一儀器廠）；Victor3 1420 Multilable Counter 酶標儀（美國BD，FACS AriaIII）；HD-3000凝膠成像儀（上海上天精密儀器有限公司）；7230G數顯可見紫外分光光度計測定儀（上海菁華）。

1.2 RGC-5 細胞培養

采用DMEM 完全培養基培養RGC-5 細胞，置于37℃、5% CO2的恒濕培養箱，待細胞貼壁生長至90%左右，便棄去舊培養基，用無菌PBS 清洗細胞2 次，加入胰酶進行消化，待細胞變圓后加入培養基終止消化，離心、重懸后以1:3 比例進行傳代培養。

1.3 細胞增殖檢測

取對數生長期的細胞消化、離心、重懸、調整密度，以1×104個/孔細胞數接種于96 孔板中持續培養24 h，棄去每孔中的培養基，加入含不同濃度黃芪多糖（0.25、0.5、1.0 mg·mL-1）和LPS（1.0 μg·mL-1）共同干預處理24 h 后，吸干板內培養基，然后每孔加入含10 μL CCK8 試劑的無血清培養再繼續孵育1 h，酶標儀于450 nm 波長處檢測每孔的吸光度值。

1.4 檢測炎性因子IL-6、TNF-α 水平

取對數生長期的RGC-5 細胞，清洗、消化、重懸細胞后，以5×105個/孔接種于6 孔板中，每組實驗設置6 個復孔，37℃、5%CO2的培養箱中培養過夜。加入含不同濃度黃芪多糖（0.25、0.5、1.0 mg·mL-1）和LPS（1.0 μg·mL-1）共同干預處理24 h 后，收集細胞上清及細胞。ELISA 試劑盒用于上清炎性因子IL-6、TNF-α 水平檢測，操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.5 Traf6、TAK1 和p-TAK1 蛋白表達

將收集的細胞裂解，測定蛋白濃度后，裂解液中加入上樣緩沖液，100℃加熱煮沸10 min。電泳時，每孔上樣蛋白量為40 μg，在12%的SDS-PAGE 凝膠中電泳分離，濃縮膠電泳分離時電壓設置為70 V，分離膠電泳時電壓設置為120 V；分離完成后在275 mA電流轉膜60 min；再將NC 膜用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；一抗孵育過夜后，再二抗常溫下孵育1 h，洗膜3 次，顯色成像。

1.6 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（）表示，數據符合正態分布，兩兩組間比較采用方差分析中LSD-t 檢驗。當P＜0.05時，差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 AP 對RGC-5 細胞相對存活率的影響

LPS 能明顯抑制RGC-5 細胞的增殖，表現在LPS 誘導組細胞相對存活率（48.7±3.92）%相對于空白對照組而言顯著降低，差異有統計學意義（t=7.437，P＜0.05）；經過低、中、高劑量黃芪多糖干預RGC-5細胞后，細胞增殖能力明顯增強，表現在不同劑量黃芪多糖組中細胞相對存活率[低劑量（61.4±3.09）%、中劑量（72.4±2.96）%、高劑量（82.6±3.07）%]均顯著高于LPS 誘導組，差異有統計學意義（t低=9.042，P＜0.05；t中=12.046，P＜0.05；t高=4.327，P＜0.05），并且隨著藥物濃度升高細胞相對存活率也隨之增高，表現出濃度依賴性。

圖1 RGC-5 細胞光學顯微鏡下圖像

圖2 AP 對視網膜神經節細胞相對存活率的影響

2.2 AP 對RGC-5 細胞上清中IL-6、TNF-α 水平的影響

LPS 能誘導RGC-5 細胞IL-6、TNF-α 的釋放，表現在LPS 誘導組中細胞上清IL-6、TNF-α 水平相對于空白對照組而言顯著升高，比較有統計學意義（t=11.209，P＜0.05）；經過低、中、高劑量黃芪多糖干預RGC-5 細胞后，細胞炎性因子水平明顯降低，表現在不同劑量黃芪多糖組中細胞上清IL-6、TNF-α水平均顯著低于LPS 誘導組，比較有統計學意義（t=9.307，P＜0.05），并且隨著藥物濃度升高細胞上清中IL-6、TNF-α 水平也隨之降低，表現出濃度依賴性。

表1 AP 對視網膜神經節細胞炎癥因子水平的影響

2.3 AP 對RGC-5 細胞Traf6/TAK1 信號通路的影響

LPS 誘導組細胞中Traf6、p-TAK1 水平相比空白對照組升高，比較有統計學意義（t=5.183，P＜0.05）；經過低、中、高劑量AP 干預RGC-5 細胞后，Traf6、p-TAK1 水平均低于LPS 誘導組，差異比較有統計學意義（t=5.603，P＜0.05），并且隨著藥物濃度升高細胞Traf6、p-TAK1 水平也隨之降低，表現出濃度依賴性。

圖3 AP 對視網膜神經節細胞Traf6/TAK1 信號通路的影響。3A Traf6 和p-TAK1 蛋白條帶；3B 對Traf6 表達水平影響；3C 對p-TAK1 達水平影響。LPS：脂多糖，Traf6：腫瘤壞死因子相關受體因子6，TAK1：轉化生長因子激酶1

3 討論

視網膜是重要的光感受器官，可以感知視覺信號進一步進行處理，然而一旦出現損傷就會引起視覺障礙或者失明。視網膜神經節細胞（RGCs）為視網膜信號輸出的細胞，以動作電位形式把經視網膜神經回路加工、處理、傳遞至視覺中樞，進一步產生正常視覺[7-8]。在多種刺激環境下，會引起視網膜氧化應激反應，激活NF-κB 信號通路，并啟動下游靶基因的轉錄，誘導炎性因子（IL-6、TNF-α）和黏附分子相互作用，進一步造成視網膜毛細血管阻塞無灌注、內皮損傷、新生血管形成等多個病理過程[9-10]。因此，抑制視網膜神經節細胞炎癥反應可以很好的保護眼部免受損傷。

中醫藥治療青光眼有確切的治療效果[11-12]。黃芪在臨床上主要用于補氣，主要應用于糖尿病視網膜病變及糖尿病腎病。黃芪多糖是黃芪中主要的活性物質，對心肌細胞具有較好的保護作用，還表現出清除自由基、調節免疫、改善微循環以及清除炎性因子等多方面的藥理活性[1-2]。并且研究還發現黃芪多糖對周圍神經損傷的功能恢復具有促進作用，早期治療的效果更顯著[13]。本研究先通過CCK8 實驗觀察不同濃度黃芪多糖對RGC-5 細胞藥物毒性的作用，發現0.1～2.0 mg·mL-1的黃芪多糖對RGC-5 細胞的增殖活性沒有明顯影響，并且細胞形態也沒有發生明顯變化。因此，實驗采用0.25、0.5、1.0 mg·mL-1的黃芪多糖處理RGC-5 細胞，進行后續實驗。研究采用了LPS 體外誘導視網膜神經節細胞炎性模型，觀察黃芪多糖對RGC-5 細胞炎性損傷的保護作用。結果發現黃芪多糖能明顯增高RGC-5 細胞的相對存活率，并且不同劑量黃芪多糖能明顯抑制炎性因子IL-6、TNF-α 的產生，且表現出濃度依賴性。

腫瘤壞死因子相關受體因子6（Traf6）屬于一種銜接蛋白，可傳導膜上多種受體介導的信號，其中就包括Toll/IL 受體家族介導的信號傳導。LPS 刺激可引起Traf6 的泛素化，接著與轉化生長因子β 活化激酶1（TAK1）作用形成復合物，進一步激活IKB激酶家族(IKB kinases,IKKs)，促使了NF-κB 向細胞核內的轉移，導致炎癥反應的發生，包括炎癥因子IL-6 和TNF-α 水平的升高[14]。對Traf6/TAK1 信號通路進行抑制可以降低炎癥因子的產生，減輕細胞的炎性損傷。Traf6 在視網膜神經節細胞損傷過程呈表達升高的趨勢，可能與青光眼的發病機制相關[15]。本文研究發現黃芪多糖能明顯抑制Traf6 和p-TAK1表達，降低了Traf6/TAK1 信號通路的活化，進一步降低炎癥反應。綜上所述，黃芪多糖可以抑制Traf6/TAK1 信號通路的活化，降低炎性因子IL-6 和TNF-α 的產生，起到抗炎的作用。