轉(zhuǎn)ｃｒｙ１Ａｂ/ｃｒｙ１Ａｃ基因水稻ＴＴ５１－１中外源基因多重ＰＣＲ檢測方法

查中萍 萬丙良 殷得所 杜雪樹 李進波 夏明元 戚華雄 李圓夢

摘要：針對轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因抗蟲水稻（Oryza sativa L.）TT51-1及其回交后代中外源基因的檢測建立了一種三引物多重PCR檢測方法。結(jié)果表明，三引物PCR體系可以準確區(qū)分cry1Ab/cry1Ac基因純合、雜合和陰性三種基因型，純合體中只擴增出一條298 bp片段，陰性材料中只擴增出一條787 bp片段，雜合體中同時擴增出298 bp片段和787 bp片段。該體系的建立為利用TT51-1進行抗螟蟲水稻分子育種提供了一個簡便有效的基因鑒定技術。

關鍵詞：轉(zhuǎn)基因水稻;多重PCR;cry1Ab/cry1Ac;TT51-1;華恢1號

中圖分類號：S511 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）24-0232-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.24.056 ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

A tri-primer multiplex PCR method for the detection of exogenous genes in the cry1Ab/cry1Ac transgenic rice TT51-1

ZHA Zhong-ping1，WAN Bing-liang1，YIN De-suo1，DU Xue-shu1，LI Jin-bo1，

XIA Ming-yuan1，QI Hua-xiong1，LI Yuan-meng2

（1.Food Crop Research Institute，Hubei Academy of Agricultural Science/Hubei Key Laboratory of Crop Germplasm and Genetic Improvement，Wuhan 430064，China;2.College of Agriculture，Yangtze University，Jingzhou 434025，Hubei，China）

Abstract： A tri-primer multiplex PCR method was established for the detection of cry1Ab/cry1Ac gene in the cry1Ab/cry1Ac transgenic rice TT51-1 and its backcross progenies of Huahui No.1. According to the foreign gene sequence inserted in TT51-1 and the rice genome sequence on the left and right sides of the insertion site， three PCR primers P1， P2 and P3 were designed. The results showed that the three primers PCR system could accurately distinguish the homozygous， heterozygous and negative genotypes of cry1Ab/cry1Ac gene. Only one 298 bp fragment was amplified in homozygote and only one 787 bp fragment was amplified in negative materials. Both 298 bp and 787 bp fragments were amplified from the heterozygote. The establishment of this system provides a simple and effective gene identification technique for molecular breeding of borer-resistant rice using TT51-1.

Key words： transgenic rice; multiplex PCR; cry1Ab/cry1Ac; TT51-1; Huahui No.1

稻縱卷葉螟、二化螟和三化螟是水稻（Oryza sativa L.）的主要害蟲，其危害會造成葉片枯白、枯心苗、白穗，癟谷大量增加，嚴重影響水稻產(chǎn)量。轉(zhuǎn)Bt毒蛋白基因水稻對稻縱卷葉螟、二化螟和三化螟具有良好的抗性，種植Bt水稻既可以有效避免稻縱卷葉螟、二化螟和三化螟對水稻的危害，又可以減少殺蟲劑的使用，減輕環(huán)境污染。水稻科學家們已經(jīng)培育出一系列Bt基因水稻[1-4]，這些Bt水稻為培育抗螟蟲水稻新品種提供了種質(zhì)資源。轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因抗蟲水稻華恢1號是華中農(nóng)業(yè)大學培育的無標記基因抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻品系，該品系已獲得國家轉(zhuǎn)基因水稻安全證書，同華恢1號的無標記基因株系為TT51-1。國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項實施以來，現(xiàn)有數(shù)十個國家級及省級研究機構(gòu)和高等院校以TT51-1作為抗蟲水稻育種的基因供體親本，優(yōu)良常規(guī)水稻品種（品系）作受體親本進行雜交（回交）選育，在選育過程中利用分子標記對抗蟲基因進行跟蹤，從而選育出抗螟蟲的優(yōu)良水稻新品種（品系）。目前所用的檢測cry1Ab/cry1Ac基因的分子標記主要是根據(jù)導入的外源基因片段序列設計的特異顯性標記，該標記只能檢測目標基因的有無，不能區(qū)分雜合基因型和純合基因型，需要在下一代對基因型進行驗證，因此顯性標記檢測效率低、耗費時力。多重PCR標記可以有效鑒別雜合基因型和純合基因型，提高選擇效率，加快育種進程[5-7]。

本研究根據(jù)TT51-1中插入的外源基因左側(cè)水稻基因組序列設計一個正向引物P1，根據(jù)插入位點右旁側(cè)水稻基因組序列設計一個反向引物P3，在插入的外源基因序列靠近左側(cè)水稻基因組處設計一個反向引物P2。利用三引物進行多重PCR擴增，在非轉(zhuǎn)基因水稻和純合轉(zhuǎn)基因水稻中分別擴增出大小不同的一個片段，在轉(zhuǎn)基因雜合體中同時擴增出兩個片段。因此該體系可以鑒定出轉(zhuǎn)基因純合、轉(zhuǎn)基因雜合和轉(zhuǎn)基因陰性三種基因型，為利用TT51-1進行抗螟蟲水稻分子育種提供了一個簡便有效的基因鑒定技術。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?水稻材料 ?轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因抗蟲水稻TT51-1（純合系）由華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室/國家植物基因研究中心（武漢）提供。非轉(zhuǎn)基因水稻R650由湖北省糧食作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與遺傳育種重點實驗室保存。

以非轉(zhuǎn)基因水稻R650母本，TT51-1為父本進行雜交，獲得cry1Ab/cry1Ac基因雜合的F1代，F(xiàn)1代與R650回交獲得BC2F1代，分子標記檢測陽性單株繼續(xù)回交獲得BC3F1代，根據(jù)分子檢測和農(nóng)藝性狀考察結(jié)果，在BC3F1代中收獲陽性單株20株。種植20個BC3F1單株的種子獲得BC3F2群體，對該群體單株進行三引物PCR檢測，選擇30個Bt陽性單株收種并種植該30個單株種子成30個BC3F3株系，通過三引物檢測獲得外源基因純合的株系。

1.1.2 ?試劑 ?DNA提取和PCR檢測試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?DNA提取 ?取1～2 cm長的水稻幼嫩葉片置于2 mL圓底離心管中，加入2×CTAB 400 μL后在QIAGEN Tissue lyser樣品研磨儀中磨碎勻漿，置60 ℃水浴20 min，加入400 μL氯仿/異戊醇（24∶1）震蕩混勻10 min，10 000 r/min離心10 min，取200 μL上清置于另一加有400 μL 95%預冷乙醇溶液的1.5 mL離心管，靜置10 min，13 000 r/min離心10 min，棄上清后晾干，加入50 μL滅菌的超純水溶解。

1.2.2 ?三引物設計 ?在轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因抗蟲水稻TT51-1中T-DNA靠近右側(cè)水稻基因組處設計一條正向引物P1，序列為5-ataataccgcgccacatagc-3。T-DNA序列左側(cè)水稻基因組序列中設計一條正向引物P3，序列為5-tcttccctagggcaaagtca-3;在T-DNA序列右側(cè)水稻基因組序列中設計一條反向引物P2，序列為5-aaaaacagagcctcgttgga-3。T-DNA的插入位點和引物位置見圖1a，T-DNA的側(cè)翼序列見圖1b。在非轉(zhuǎn)基因水稻中，P3+P2擴增出一條787 bp的PCR產(chǎn)物;在轉(zhuǎn)基因純合體中，P1+P2擴增出一條298 bp的PCR產(chǎn)物，由于T-DNA序列過長，P3+P2沒有擴增產(chǎn)物。在轉(zhuǎn)基因雜合體中同時擴增出787 bp和298 bp的2條PCR產(chǎn)物。

1.2.3 ?三引物多重PCR檢測體系 ?PCR反應體系為15 μL，包含10×PCR 緩沖液（含Mg2+）1.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.2 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL，DNA模板1 μL和適當量的三引物P1、P2、P3。P1、P2和P3濃度為10 μmol/L，P1、P2、P3引物使用量分別為0.15、0.30、0.15 μL。PCR反應程序為94 ℃預變性4 min;94 ℃變性40 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸40 s，30個循環(huán);72 ℃延伸5 min。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?二引物及三引物PCR體系對水稻材料擴增的特異性

以轉(zhuǎn)基因材料TT51-1、非轉(zhuǎn)基因水稻R650及TT51-1×R650的F1 DNA為模板，利用二引物P1+P2、P3+P2及三引物P1+P2+P3體系進行PCR擴增，結(jié)果見圖2。用P1+P2二引物體系時，在轉(zhuǎn)基因材料TT51-1、TT51-1×R650的F1 DNA中擴增出一條約298 bp的片段，在非轉(zhuǎn)基因材料R650中沒有擴增產(chǎn)物（圖2a）;用P3+P2二引物體系時，在轉(zhuǎn)基因材料TT51-1中沒有擴增產(chǎn)物，在非轉(zhuǎn)基因材料R650、TT51-1×R650的F1 DNA中擴增出一條約787 bp的片段（圖2b）;用P1+P2+P3體系進行PCR時，在轉(zhuǎn)基因材料TT51-1中擴增出一條約298 bp的片段，非轉(zhuǎn)基因材料R650中擴增出一條約787 bp的片段，在TT51-1×R650的F1 DNA中能同時擴增出298 bp和787 bp兩條片段。

2.2 ?三引物多重PCR擴增體系在轉(zhuǎn)基因后代材料中的驗證

利用二引物P1+P2、P3+P2及三重引物P1+P2+P3 PCR擴增體系對TT51-1與非轉(zhuǎn)基因水稻R650回交后代BC3F2 8個不同單株進行檢測，結(jié)果見圖3a、圖3b、圖3c。利用二引物PCR檢測時，在TT51-1中僅能擴增出一條298 bp的陽性片段，在R650僅能擴增出787 bp陰性片段;二引物PCR對回交后代BC3F2不同單株進行檢測，所有株系只能顯示一條帶（圖3a、圖3b），僅能檢測轉(zhuǎn)基因后代外源基因的有無，不能區(qū)分轉(zhuǎn)基因是雜合還是純合;而利用三引物檢測，同二引物檢測結(jié)果一樣，在TT51-1中僅能擴增出一條298 bp的片段，在R650僅能擴增出787 bp陰性片段;轉(zhuǎn)基因純合單株能擴增出一條陽性片段，轉(zhuǎn)基因陰性株系只能擴增出一條陰性片段，而轉(zhuǎn)基因雜合株系能同時擴增出298 bp和787 bp的片段（圖3c）。檢測結(jié)果表明，這些材料中該三因素PCR擴增體系可以準確地區(qū)分轉(zhuǎn)基因雜合體、轉(zhuǎn)基因陽性純合體和轉(zhuǎn)基因陰性純合材料。

收獲8株的BC3F2種子種植為BC3F3代株系，取20株進行三引物PCR檢測（圖4）。結(jié)果表明， 來自BC3F2代轉(zhuǎn)基因純合和轉(zhuǎn)基因陰性單株的BC3F3家系目標基因穩(wěn)定，為轉(zhuǎn)基因純合和轉(zhuǎn)基因陰性基因型（圖4a、圖4b），而來自BC3F2代轉(zhuǎn)基因雜合單株的BC3F3家系中目標基因發(fā)生分離，出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因雜合、轉(zhuǎn)基因純合和轉(zhuǎn)基因陰性單株（圖4c）。結(jié)果表明，利用該三引物多重PCR擴增體系可以準確地鑒定出TT51-1及其衍生的后代材料中轉(zhuǎn)基因雜合、轉(zhuǎn)基因純合和轉(zhuǎn)基因陰性植株。

3 ?討論

建立了用于檢測轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1及其回交后代材料中外源基因的三引物多重PCR檢測體系，該體系可以準確簡便地區(qū)分出轉(zhuǎn)基因雜合、轉(zhuǎn)基因純合和轉(zhuǎn)基因陰性3種基因型，為利用TT51-1進行分子標記輔助育種提供了一種簡單有效地鑒別植株基因型的技術方法。

多重PCR技術利用一次PCR反應檢測多個靶標DNA片段，相比傳統(tǒng)PCR省時省力。該技術已廣泛地應用于轉(zhuǎn)基因植物的檢測，主要是用于同時檢測多個外源基因成分的存在[8-10]，也有利用外源基因插入的側(cè)翼序列設計共顯性引物標記進行多重PCR檢測轉(zhuǎn)基因的基因型[5-7]。但不同的外源基因，不同的轉(zhuǎn)化事件，其涉及的DNA序列不同，引物也就不同，PCR反應條件也不相同。

本研究根據(jù)TT51-1中特異轉(zhuǎn)化事件，設計了3個特異引物，通過對轉(zhuǎn)基因供體、轉(zhuǎn)基因受體及回交后代不同單株的擴增驗證，證明該體系可簡單有效地應用于TT51-1及其衍生材料中外源基因型的檢測。

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