大別山區茶樹種質資源多樣性的ISSR分析

杜婷婷

摘 要 大別山區茶樹栽培歷史悠久，有著豐富的茶樹種質資源，對茶樹的品種選育和生物技術的研究有著很大的作用。最近幾年已經發展日益成熟的ISSR簡單重復序列間隔區技術，已經能夠從DNA反應出來的水平展示出各個材料之間的差別和遺傳特點，這個方法技術已經成為研究生物遺傳多樣性的非常有利的工具，并且方法簡單，使用方便快捷。本文以舒城縣舒茶鎮九一六茶園為實驗材料進行茶樹種質多樣性的ISSR分析。此次研究可為大別山區茶樹的持續發展利用以及生物多樣性的保護提供部分參考依據。

關鍵詞 大別山區 茶樹 種質資源 ISSR 多樣性分析

中圖分類號：S567文獻標識碼：A

0引言

茶樹的種質資源是自然進化的產物，它在生長進化過程中由于各種外界和內部的因素產生了很多的遺傳變異，而這些遺傳基因中包含著許多決定它們各種特征的基因。而茶樹進行育種的主要基礎是茶樹的種質資源，茶樹育種是對茶樹種質資源的基因選擇，并且利用優質種質資源對茶樹進行育種。當前世界各地的產茶國對茶樹種質資源的采集和改進是十分關注的，茶葉市場的不斷發展和茶葉的科技創新是離不開茶樹種質資源的開發利用的。

1大別山茶樹種質資源多樣性的ISSR分析

1.1供試材料樣本的收集

實驗材料采自舒城縣舒茶鎮九一六茶園，共計20份茶樹種質資源，從所選取的20份茶樹種質資源中采取其較嫩的新梢葉片，采用硅膠干燥法收集樣品，并于-20℃冰箱保存，然后用于基因組DNA的提取。

1.2供試材料DNA的提取

實驗前對儀器進行提前滅菌，實驗過程中對操作儀器應該輕拿輕放，避免因為劇烈的震動而對實驗造成影響。采用改良CTAB法提取收集到的20份樣本基因組DNA，其操作方法為：（1）將CATA緩沖液置于65℃水浴預熱，同時開始制冰。（2）稱取0.5g處理后的茶樹葉片，進行研磨，形成茶粉。（3）取0.1g研磨后的茶粉加入EP試管中，加入1ml預冷的TE清洗液和10ul巰基乙醇，進行冰浴。（4）取出EP管進行離心實驗。（5）取出EP管，將上清液進行吸取轉移到另外一個新的EP試管中，加入2ml無水乙醇，混勻后靜置，讓核酸沉淀。（6）把絮狀沉淀物挑入加入800ul的75%乙醇的1.5ulEP中，進行洗滌沉淀操作，在室溫環境下使DNA沉淀干燥。（7）使得到的DNA沉淀在50ul的ddH2O中，在-20℃中保存。（8）設置空白參照，取樣品1ul置于蛋白核酸檢測儀針頭上檢測，得出檢測結果。

通過CTAB法提取20份樣本的基因組DNA，根據得出的電泳圖可以得知OD260/OD28的值處于1.8和2.0之間，表明此次實驗所采用的材料和方法提取的茶葉種質資源DNA的效果比較好，得到的DNA的濃度、純度都比較高。

1.3 ISSR對茶樹遺傳多樣性和親緣關系的分析

在20份茶樹DNA提取的基礎上，用擴增產物多態性好、穩定性高的ISSR引物用于樣本DNA擴增。

根據20中茶樹種質資源的ISSR聚類分析圖譜，可以得知：供試材料間的遺傳相似系數GS值在0.589～0.774之間。其中，舒城大葉種和舒城藥茶的GS值為0.778，二者的遺傳關系最為相近。而GS值最小的是平陽特旱和日本群體種，GS值是0.589，表示平陽特旱和日本群體種的親緣關系最遠。根據遺傳相似系數按UPGMA方法進行聚類，當遺傳距離為0.730時，可以將20份茶樹種質資源分為五大類。其中，D類還有12個茶樹種質資源，占實驗材料中所有種質資源的60%，表明舒城縣其特有的茶葉種質資源有著獨特的遺傳基因。

對大別山區茶樹種質資源20分樣本進行擴增，共得到了36個位點，多態性比率是95.2%，擴增條帶的大小介于250～1800kb之間。以最具代表性的舒城大葉種為中心，按照方位組建的四個方位群居中，多態性位點最多的是東北群落，而最少的是西南群落。四個方位的群落中在群內發生遺傳變異的概率比較大。在眾多ISSR標記位點處，基因流的平均值為1.6223，僅僅能夠抵質遺傳漂變引起的基因變異。各種茶樹種質資源在一定程度上具有一定的親緣關系，它們的基因相似性是基于它們的親緣關系，舒城大葉種、舒城藥茶和平陽特旱種質資源遺傳多樣性比較豐富，并且在DNA的遺傳上具有很好的穩定性。

2結語

對茶樹種質資源多樣性的分析使用DNA分子標記法是非常可行的，因為DNA在遺傳上具有穩定性，而茶樹的一些特征受到環境因素的影響是比較大的，因此，對茶樹種質資源的多樣性分析，ISSR分析方法能夠更好地研究其種質資源的遺傳多樣性，并且能有效的鑒別出不同種類的茶葉種質資源。部分茶樹經過長期的自然選擇，與不同種類的茶樹進行基因交流，使得大別山區的部分茶樹資源也發生了轉變。隨著污染日益嚴重，許多動植物種類已經消失，因此，通過對大別山區茶樹種質資源的分析研究，可以為茶樹的保護以及育種等提供參考性依據。

基金項目：2017年安徽省教育廳自然科學研究一般項目“大別山區茶樹種質資源多樣性的ISSR分析”（KJ2017B03）。

參考文獻

[1] 王小萍，張廳，黃梅等.四川地區茶樹種質資源葉表型性狀多樣性分析[J].中國農學通報，2018，34（04）：89-94.

[2] 黎釗，肖斌，余有本等.基于STR分型檢測技術的89份茶樹種質資源遺傳多樣性分析[J].西北農林科技大學學報（自然科學版），2017，45（01）：140-146.