HPLC法測定復方苯甲酸軟膏中苯甲酸和水楊酸的含量

張榮琴

(平頂山市食品藥品檢驗所、藥理室，河南 平頂山467000)

復方苯甲酸軟膏收錄于《中國醫院制劑規范》（第二版）[1]，是一類主要由羊毛脂、凡士林、苯甲酸和水楊酸依據一定比例組成的復方制劑。其對真菌生長具有顯著的抑菌作用，臨床上主要治療手癬、腳癬、體癬、股癬等皮膚癬癥或淺部真菌病。

復方苯甲酸軟膏兩組分含量在原質量標準中通過紫外分光光度法測定，但該方法費時費力，提取過程復雜，回收率低[2]。而本研究采用的高效液相色譜法 （high performance liquid chromatography，HPLC）是多種制劑的質量控制方法，具有簡便、快速、準確的優勢[3]。故而，本研究使用HPLC法測定復方苯甲酸軟膏中苯甲酸和水楊酸的含量，旨在探尋更好地測定復方苯甲酸軟膏苯甲酸和水楊酸含量的方法。

1 儀器與方法

1.1 儀器 Agilent1200高效液相色譜系統（含486紫外檢測器及510泵）及U6K進樣閥(美國安捷倫科技有限公司）

1.2 藥物 復方苯甲酸軟膏由中國食品藥品檢定研究院提供，(批號：20161202，規格：每盒 20g；色譜純采用甲醇，分析純使用磷酸二氫鈉，水楊酸對照品(純度：99.9%、批號：100106-201104)；苯甲酸對照品(純度：100%、批號：100419-200301)。

1.3 實驗方法 以色譜柱為Diamonsil C18，230nm檢測波長，甲醇-0.1%磷酸溶液（45：55）為流動相，1.0ml/min流速，40℃柱溫為色譜柱條件，進行試驗[4]。

對照品溶液制備：精密稱定0.0598g、0.0308g水楊酸、苯甲酸對照品，50%甲醇溶液溶解于100ml量瓶中并稀釋至刻度，得對照品儲備液并分出5ml，加流動相稀釋至25ml刻度，得對照品溶液[5]。

供試品溶液：復方苯甲酸軟膏0.5g精密稱取，加無水乙醇30ml于置50ml量瓶中溶解，搖勻后50%甲醇溶液定容至刻度，冰浴1h后，上清液5ml精密量取，流動相置于25ml量瓶稀釋至刻度，微孔濾膜（0.45μm）濾過后續濾液即為供試品溶液[6]。陰性樣品溶液：取除苯甲酸、水楊酸余成分按制備工藝制成陰性樣品，以供試品溶液制備法制陰性樣品溶液[7]。

2 結果

2.1 線性范圍考察 精密稱取苯甲酸和水楊酸對照品各20mg，加50%甲醇溶液溶解至50ml，精密吸取 0.5、1、3、5、7 和 9ml，分別置于 10ml量瓶，再吸取50%甲醇溶液稀釋至10ml，搖勻，在上述色譜條件下測定，橫坐標為待測成分的檢測質量濃度（X），縱坐標為峰面積（Y），苯甲酸回歸方程為Y=2.7112X+0.3101，R2=0.9999，水楊酸回歸方程為Y=3.4721X+0.6212，R2=0.9995，表明苯甲酸、水楊酸分別在 2.11～37.98μg/ml和 1.99～35.84μg/ml范圍內，其與峰面積線性關系較好。

2.2 精密度試驗結果 精密吸取10μl對照品溶液，連續重復6次進樣，水楊酸峰和苯甲酸面積RSD分別為0.17%和0.15%，顯示所用儀器精密度良好。

2.3 穩定性試驗結果 在 0、3、6、12和 24h時，顯示苯甲酸峰面積平均值和RSD分別為4760.60和0.21%，水楊酸峰面積平均值和RSD分別為1710.50和0.10%。表明供試品溶液在24h內質量穩定。

2.4 重復性試驗 選取復方苯甲酸軟膏，制備6份供試品溶液（同供試品溶液制備方法），外標法測定苯甲酸和水楊酸含量，結果顯示苯甲酸和水楊酸含量分別為98.80%和 99.50%，RSD分別為0.28%和0.17%。顯示該方法重復性好。

2.5 加樣回收率試驗 苯甲酸、水楊酸含量樣品精密稱取，配制成高、中、低質量濃度的溶液各3份，按照上述色譜條件測定，苯甲酸和水楊酸平均加樣回收率分別為100.07%和100.01%，RSD分別為0.55%和0.51%，見表1。

2.6 樣品含量測定 將樣品平行2份，制備供試品溶液，在上述色譜條件下進樣測定峰面積，按外標法計算含量，結果見表2。

表1 加樣回收率試驗結果

3 討論

復方苯甲酸軟膏為苯甲酸與水楊酸的復方制劑，以2：1比例混合制成軟膏劑。本品中苯甲酸有抑制真菌的作用，抗細菌作用較弱；水楊酸有抑制真菌、細菌作用，具有角質溶解作用，可使表皮變松和脫落，并有止癢作用[8]。治療淺部真菌病時，被殺滅或抑制的霉菌隨表皮剝離而脫落、清除。水楊酸濃度過高有腐蝕作用，故與苯甲酸配伍，避免了水楊酸的腐蝕作用[9]。

《中國醫院制劑規范》[10]中記錄復方苯甲酸軟膏的含量測定方法是對苯甲酸和水楊酸的總酸量進行測定，該方法難以達到質量控制的目的，故而，難以達到醫院制劑的質量控制要求。

高效液相色譜以經典的液相色譜為基礎，是以高壓下的液體為流動相的色譜過程。通常所說的柱層析、薄層層析或紙層析就是經典的液相色譜。所用的固定相為大于100μm的吸附劑（硅膠、氧化鋁等），世界上約有80%的有機化合物可以用HPLC來分析測定[11-13]。本研究使用HPLC法測定復方苯甲酸軟膏中苯甲酸和水楊酸的含量，旨在探尋更好地測定復方苯甲酸軟膏中苯甲酸和水楊酸含量方法。

高效液相色譜法主要可分為以下特點：⑴速度快。載液流速快，分析速度快、通常分析一個樣品在20min左右，部分樣品5min內即可完成，較經典液相色譜法速度顯著提高；⑵壓力高。流經色譜柱時，受到的阻力較大，降低通過色譜柱的阻力，必須對載液加高壓；⑶靈敏度高。進樣量在μl數量級，紫外檢測器可達0.01ng；⑷效率高。可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果，具有較高效能；⑸廣泛的應用范圍。高效液相色譜法可對強極性、大分子、高沸點及熱穩定性差等多種類型的有機化合物進行準確分析。

本研究結果顯示苯甲酸、水楊酸分別在2.11～37.98μg/ml和 1.99～35.84μg/ml范圍內與峰面積有良好的線性關系；精密度、穩定性和重復性實驗的相對標準偏差（RSD）均＜0.30%；苯甲酸和水楊酸平均加樣回收率分別為100.07%和100.01%，RSD分別為0.55%和0.51%。上述結果顯示HPLC法測定復方苯甲酸軟膏中苯甲酸和水楊酸含量準確性和穩定性均較高，具有較高的回收率。

在研究中筆者對測定的流動相進行了相關研究，文獻[14，15]多采用緩沖鹽系統對苯甲酸和水楊酸進行測定，但利用磷酸鹽進行pH調節較為復雜且緩沖鹽對色譜柱具有較大損傷。在本研究中采用甲醇-0.1%磷酸溶液（45：55），可有效避免緩沖鹽對色譜柱的損傷和不良影響且制備流動相的過程相對簡單。在本研究流動相條件下水楊酸和苯甲酸能夠快速出峰，峰面積均取得滿意效果，可滿足快速出峰分析的要求。

通過紫外分光掃描光譜圖可知水楊酸和苯甲酸分別在300和228nm波長處存在最大吸收，但吸收大小不盡相同，水楊酸比苯甲酸要大。綜合被測物紫外最大吸收位置、被測物在處方中的含量及吸收大小等多方面因素，通過實驗，最后選擇230nm作為測定波長，峰型較好，符合測定的要求。

此外，筆者在研究的過程中認為HPLC仍有“柱外效應”等缺點，導致柱效率降低。除了進樣器、柱接頭、連接管和檢測池等柱子以外的任何死空間，在從進樣到檢測器之間后如果流動相的流型有變化，被分離物質的任何擴散和滯留均可顯著加寬色譜峰，降低柱效率，但不可否認的是HPLC應用價值仍較高。

綜上所述，HPLC法測定復方苯甲酸軟膏中苯甲酸和水楊酸含量，具有方法準確、快速、重復性好等優點。