子宮肌瘤患者孕激素受體的表達及意義

薛小芳，王玉，王利霞，崔娟，李森森，許振峰

(南陽南石醫院婦產科，河南 南陽 473000)

子宮肌瘤的整體發病率較高，在年齡大于45歲的育齡期女性人群中，子宮肌瘤的發生率可達235～545/1萬人左右[1]。現階段臨床上主要通過手術治療子宮肌瘤，但包括各種方式綜合性治療后的子宮肌瘤患者的復發率仍然較高，遠期二次手術的風險仍然超過5%[2]。

在不同的生物學分子機制中，受體水平的改變能夠促進平滑肌細胞DNA的擴增，促進平滑肌瘤的發生。孕激素受體（progesterone receptor，PR）的激活能夠誘導平滑肌細胞DNA持續性擴增，促進平滑肌細胞的增殖和間質成分的增生，促進肌瘤的形成[3，4]。PR-A/B是傳統的PR，其在促進PR受體的激活、平滑肌細胞的纖維化等方面發揮了重要的作用；PR-M是新型的PR，近年來相關研究發現PR-M能夠通過影響平滑肌細胞的線粒體代謝活性，促進ATP能量利用的增加等，顯著促進平滑肌細胞的增殖和間質成分的代償性增生[5]。為了進一步揭示PR-M、PR-A/B等因子與子宮肌瘤平滑肌細胞增殖的關系，本次研究選取2017年1月至2017年12月我院保存的子宮肌瘤組織標本21例，探討了不同亞型受體的表達。

1 材料與方法

1.1 組織來源 選取2017年1月至2017年12月我院保存的子宮肌瘤組織標本21例，年齡34～46歲，平均年齡（41.24±8.46）歲。同時選取距子宮肌瘤＞5cm正常子宮平滑肌組織作為對照，納入標準：⑴行子宮全切手術；⑵未絕經婦女；⑶多發性子宮肌瘤＜5個；⑷患者知情同意。排除標準：⑴術前3個月服用過類固醇激素類藥物；⑵伴有其他內分泌合并癥。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組化染色 石蠟切片脫蠟至水，過氧化氫封閉內源性過氧化物酶：3%H2O2，室溫10min（避光），10mMpH 6.0 枸櫞酸鈉緩沖液），PBS 沖洗5min，滴加正常山羊或兔血清封閉處理，37℃，15min。用濾紙吸去血清，不洗，直接滴加第一抗體，37℃ 2h， 滴加生物素化的二抗，37℃，40min，PBS沖洗5min，DAB顯色，蘇木素復染，加拿大樹膠（或中性樹膠）封片。

PR以細胞核呈棕黃色為陽性，隨機選取5個高倍鏡視野對細胞染色強度和陽性細胞比例進行評分，兩種評分之和≥3分為陽性表達。染色強度：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞比例：＜10%為0分，10%～30%為1分，31%～60%為2分，＞60%為3分。

1.2.2 儀器與試劑 DMEM、DMEM-F12培養基(Hyclone公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶-EDTA、PBS、Ⅰ型膠原酶(索萊寶公司)，SP試劑盒、DAP染色試劑盒(北京中山金橋公司)。

1.2.3 細胞分離、培養 使用10%的完全培養基進行培養，放置于37℃、5%CO2培養箱中，培養24~48h待細胞貼壁（融合度80%左右）進行第1次換液，以后每2～3d更換一次培養基，采用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化傳代。

1.2.4 CCK-8檢測 在96孔板中接種細胞懸液（100μL/孔），向每孔加入 10μl CCK8 溶液，將培養板在培養箱內孵育1~4h，用酶標儀測定在450nm處的吸光度，若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10μl 0.1M的HCL溶液，24h內測定，吸光度不會發生變化。

1.2.5 Western blot檢測 采用組織研磨法研磨子宮平滑肌組織，冰上放置30min，進行Bradford比色法檢測平滑肌瘤組織的蛋白濃度，采用BSA緩沖液配比（1：4），加入電泳緩沖液（比例 1：1），上樣、電泳（濃縮膠20mA，分離膠35mA），電轉膜儀轉膜（100mA 40min），10%的高脂蛋白封閉，加入養來源一抗（1：1000），封閉 4h，PBS 緩沖液洗滌 3次，每次 5min，加入鼠來源二抗（1；2000），PBS 緩沖液洗滌3次，每次5min，采用AP/NBT顯色法，進行常規的曝光和膠片的灰度讀取。

1.3 統計學處理 統計分析采用SPSS 19.0軟件，計量資料采用（）表示，組間比較使用t檢驗；計數資料采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 子宮肌瘤和正常子宮平滑肌標本PR表達比較 子宮肌瘤組織PR陽性表達率明顯高于正常子宮平滑肌組織（P＜0.05），見表 1和圖 1。

表1 子宮肌瘤和正常子宮平滑肌標本PR表達比較

圖1 免疫組化圖

2.2 子宮肌瘤和子宮平滑肌細胞PR-A、PR-B、PR-M表達比較 子宮肌瘤細胞PR-A、PR-B、PRM蛋白相對表達量明顯高于子宮平滑肌細胞 （P＜0.05）。 見表 2。

表2 子宮肌瘤和子宮平滑肌細胞PR-A、PR-B、PR-M蛋白表達（，n=6)

表2 子宮肌瘤和子宮平滑肌細胞PR-A、PR-B、PR-M蛋白表達（，n=6)

細胞 PR-A蛋白相對表達量子宮肌瘤子宮平滑肌PR-B蛋白相對表達量PR-M蛋白相對表達量t P 0.762±0.116 0.341±0.120 6.179＜0.05 0.987±0.107 0.543±0.112 7.021＜0.05 0.097±0.042 0.010±0.002 5.068＜0.05

2.3 不同PR表達類型子宮肌瘤細胞增殖情況比較 篩選出僅表達PR-M的細胞株 （PR-M陽性組）和僅表達PR-A/B的細胞株（PR-M陰性組）進行CCK-8實驗，PR-M陽性組培養24h、48h OD值明顯高于PR-M陰性組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。 見表 3。

表3 不同PR表達類型子宮肌瘤細胞增殖情況比較（，n=6)

表3 不同PR表達類型子宮肌瘤細胞增殖情況比較（，n=6)

組別 0h PR-M陽性組PR-M陰性組t P 0.211±0.087 0.204±0.090 0.137＞0.05 24h 48h 0.352±0.097 0.234±0.071 2.404＜0.05 0.411±0.091 0.301±0.089 2.117＜0.05

3 討論

不同的生物學因子機制均可以促進平滑肌細胞再生和纖維化等病理改變的進程，提高子宮肌瘤的發生風險。但現階段臨床上因子宮肌瘤導致的子宮切除率明顯上升，同時子宮肌瘤的持續性進展率、復發率等指標仍然較高[6，7]。一項包括了261例子宮肌瘤患者的治療隨訪研究提示，臨床上子宮肌瘤手術治療后的肌瘤復發率、肌瘤變性的風險可超過7%[8]。而通過對于子宮肌瘤發病過程中PR受體水平的相關分子亞型的分析，具有下列幾個方面的意義：⑴能夠為臨床上子宮肌瘤患者的生物學靶向治療提供理論基礎；⑵能夠為子宮肌瘤高危人群的篩查提供依據。

PR受體與雌激素信號通路具有一定的交錯式的激活效應，PR受體水平的激活不僅可以通過激活PR下游信號通路，還能夠通過增加雌激素下游轉錄調控機制的激活程度，促進雌激素對于平滑肌細胞的促增殖作用[9，10]。PR-A/B作為主要的PR受體亞型，其在子宮肌瘤發病過程中的作用已經得到了多數研究的證實，而關于PR-M的分析研究不足。基礎方面的研究提示，PR-M主要定位于線粒體膜周邊，其與配體結合后導致的線粒體轉錄活性的增加，能夠促進ATP能量利用率的上升，提高平滑肌細胞的代謝水平，促進平滑肌細胞的增殖[11，12]。同時，PR-M受體亞型的改變，還能夠提高平滑肌增殖過程中局部新生血管形成的速度，提高病灶部位血流灌注水平。

本次研究首先通過免疫組化分析探討了PR的表達情況，發現PR的整體表達水平明顯上升，提示PR能夠參與到子宮肌瘤的病情進展過程，PR主要通過影響到受體信號通路的激活效應，促進平滑肌細胞的增殖和間質成分的代償性增生過程。免疫組化染色分析可見，PR蛋白主要染色于平滑肌細胞較為密集的區域，特別是在間質成分增生明顯、平滑肌細胞形態改變較為顯著的區域，PR的染色強度更深，PR的表達陽性率更高。汪偉等[13]研究者也認為，PR在子宮肌瘤患者病灶組織中的表達陽性率可平均上升25%，同時在復發率子宮肌瘤或者巨大型子宮肌瘤病灶組織區域中，PR的上升更為明顯。在細胞水平進行蛋白的表達分析研究，發現子宮肌瘤細胞PR-A、PR-B、PR-M蛋白表達量均明顯高于普通的平滑肌細胞，差異較為明顯，提示了PR-A、PR-B、PR-M蛋白均參與到了平滑肌細胞的增殖和子宮肌瘤的形成過程，不同的受體亞型的變化，對于子宮肌瘤細胞的形成和增殖狀態的維持作用，主要由于其對于細胞代謝水平的改變或者細胞周期的調控作用有關，但具體的機制仍然要增加樣本量、設立基礎研究對照組進一步分析。最后本研究發現，PR-M陽性組培養24h、48h OD值明顯高于PR-M陰性組，OD值的提升提示了PR-M陽性組子宮肌瘤細胞的增殖活性較高，表明PR-M對于子宮肌瘤細胞具有顯著的促增殖作用，其促增殖活性明顯強于PR-A、PR-B組，這主要由于PR-M能夠直接影響到平滑肌細胞的內部細胞器的代謝、提高線粒體的能量代謝活性[14-16]。

綜上所述，子宮肌瘤組織以及細胞PR表達升高，其中PR-M蛋白可能與子宮肌瘤細胞增殖有關，值得進一步研究。