江西地區(qū)RhD陰性個體的RHD基因與RhCcEe抗原的表達分析

苗燕平，周小英，熊莉，何華慶，李國良，孫瑜

(江西省血液中心，江西 南昌 330052)

Rh血型系統(tǒng)幾乎是除了ABO血型系統(tǒng)外最重要的血型系統(tǒng)，是人類最復雜和最具多態(tài)性的紅細胞血型系統(tǒng)[1]，由位于1號染色體短臂上兩個緊密連鎖的RHD和RHCE基因編碼，兩者之間的同源性大于96%，極易發(fā)生重組交換和不等交換，產(chǎn)生眾多的RHD和RHCE基因變異體，從而影響Rh系統(tǒng)抗原的表達。Rh系統(tǒng)各抗原均有重要的臨床意義，如胎母免疫、臨床輸血等，本研究試圖從RhCcEe抗原表達的角度探討江西地區(qū)RhD陰性人群的分子背景，確認本地區(qū)相關血型系統(tǒng)的特點，為臨床醫(yī)療提供一定的參考，現(xiàn)報告如下：

1 材料與方法

1.1 樣本來源 江西省血液中心RhD初篩陰性的無償獻血者464名，均為無關人群，年齡18~54周歲，均經(jīng)研究對象知情同意后采集標本備用。

1.2 主要試劑 血清學試劑中，單克隆抗-C、抗-E、抗-c、抗-e、抗體篩查試劑、抗人球蛋白試劑均來自上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司，抗-D抗體分別來自北京金豪、上海血液生物和德國BIOSCOT；基因?qū)W試劑有基因組DNA提取試劑盒 （TBG公司）、Taq酶（Promega公司）、RHD 基因分型試劑盒（PCR-SSP法）（天津秀鵬公司）。所有試劑均按說明書在有效期內(nèi)使用。

1.3 Rh血型系統(tǒng)抗原檢測 血清學直接凝集法檢測 D、C、c、E、e 抗原，間接抗人球蛋白試驗（IAT）確認RhD陰性血型[2]。

1.4 RHD基因分型 對IAT確認為RhD抗原陰性的樣本，隨機抽取111例，使用PCR-SSP法行RHD基因分型。

1.5 統(tǒng)計學分析 使用直接計數(shù)法計算各血型；使用SPSS 19.0對所得數(shù)據(jù)行統(tǒng)計分析，檢驗水準設為0.05。

2 結(jié)果

2.1 RhD血清學結(jié)果 464例標本中，確認為RhD陰性者 451例 (97.1983%)，RhD變異性 13例（2.8017%）。

2.2 RHD基因型與RhCcEe抗原的關系 排除D變異型后，隨機抽取111名RhD確認陰性者，使用PCR-SSP方法檢測其RHD基因，表型的分布見表1和表2。

3 討論

Rh血型抗原由2個具有共顯性的連鎖基因RHD和RHCE基因編碼，在染色體上緊密連鎖，而且堿基序列非常類似，各含10個外顯子，同源性大于96%，這2個血型基因是產(chǎn)生不同Rh表型的遺傳基礎，而表型是臨床免疫反應的基礎。隨著RhD抗原臨床免疫預防的進一步規(guī)范，反襯出RhCcEe抗原在臨床輸血和胎母免疫中的問題越來越突出，RhCcEe抗體引起的新生兒溶血病(HDN)逐年增加，而受血者血清中的同種抗體70%～80%與 RhCcEe抗體有關[3]。2008 年，蘭炯采[4]等便發(fā)現(xiàn)RhD陰性而存在RHD基因的個體，其表型均為RhC陽性，即CC或Cc，推測或在RhD陰性個體中，RHD基因和RhC表型間存在某種聯(lián)系，2014年，陳青[5]等人發(fā)現(xiàn)在江蘇地區(qū)人群中，RhD陰性而存在RHD基因的個體中，RHCE*C基因的0.4811，本研究由此得到啟示，試圖發(fā)現(xiàn)本地區(qū)RhD陰性人群RhCcEe表型及其與RHD基因間的關系，從此角度探討RhD的分子背景。

由于目前“紅細胞膜D抗原有無”的檢測技術標準是經(jīng)典IAT技術，本研究使用3種抗D試劑以間接抗人球蛋白實驗（IAT）檢測RhD抗原以確認RhD陰性[6]，但事實上，以往有研究報道，使用血清學方法確定的RhD陰性人群中，有20%～30%為放散型[7，8]，本研究未行吸收放散實驗，選擇的標本理論上包括了Del型，但是，2010年國內(nèi)1個由10家血液中心組成的“Del母同種免疫觀察”小組[9]，初步觀察數(shù)百例真實RhD陰性和Del孕婦妊娠RhD陽性胎兒是否發(fā)生抗-D同種免疫反應時發(fā)現(xiàn)，無1例Del孕婦發(fā)生抗-D同種免疫反應，即使其生育＞4次；他們還同時回顧性研究了200多名抗-D陽性的孕婦，結(jié)果無1例檢測為Del型，且目前，有關Del型致敏的文獻并不多見，考慮到Del型臨床意義不大，再加上目前Del型的檢測所使用的吸收放散實驗與操作者水平密切相關，結(jié)果的穩(wěn)定性和重復性并不盡如人意，所以，本研究選擇的標本未剔除Del型。

表1 RhD陰性人群RHD基因型與RhCcEe表型的分布關系（n=111）

表2 RHD外顯子與RhCcEe抗原表達的關系（n=111）

本研究發(fā)現(xiàn)，在111名檢測了RHD基因的人群中，九種理論上的RhCcEe表型只檢出了五種，其中最多的是ccee(54.96%)，其次是Ccee（32.43%），緊隨其后的是CCee（7.21%）和CcEe（2.70%）與 ccEe（2.70%），雖然在人群所占比例上與其他實驗室有出入[10，11]，甚至與本室其他時間內(nèi)不同實驗所得結(jié)果也有出入[12-14]，但ccee和Ccee占據(jù)順序前兩位是一致的，我們認為，這表明各表型在人群中所占比例的結(jié)果雖然與地區(qū)差異和標本量大小導致的穩(wěn)定性有關，但是該影響因素在比例較大的表型中的影響不足以改變其在整體中的排列順序，所以不論在哪個調(diào)查中，ccee和Ccee均是主要表型。假如對我們幾次的調(diào)查做一個統(tǒng)一的研究，或者會更接近于群體的真像，這部分工作將留待進一步的研究后確認。但是作為遺傳標志物，血型具有地域特征，本次調(diào)查的Rh系統(tǒng)血型對研究江西地區(qū)RhD陰性人群遺傳學特征來說有一定的意義。

PCR-SSP試劑盒僅僅在111名RhD陰性的獻血者中檢出了6種RHD等位基因，根據(jù)外顯子是否完整將其分為三大類，在Fisher精確概率法的提示下，外顯子完整性不同的RHD陰性獻血者，其RhCcEe表型是有差異的，我們初步判斷雖然有地區(qū)差異，但RHD基因外顯子的差異可能決定了CcEe抗原表達的差異，但是，從本次調(diào)查的RHD（-）基因者僅占被調(diào)查的RhD陰性人群的4.50%（5/111）來看，調(diào)查是有抽樣誤差的，我們尚須加大樣本量，獲得更多標本，方能接近更具群體特征的數(shù)據(jù)。國際上經(jīng)RHD全基因序列分析鑒定和Genebank登錄的部分D中顯示的D類別（D category）中，本次實驗只發(fā)現(xiàn)了其中的兩種，即D Cat.VIⅢ和RHD-CE(2-9)-D，部分D多是由于RHD基因一部分被相應RHCE基因部分替換形成的RHD/CE融合等位基因，理論上，這個分子基礎足以對出現(xiàn)部分D的Rh陰性人群的RhCcEe的表達有極大影響，但因本研究中樣本量不足，僅從本次數(shù)據(jù)中無法發(fā)現(xiàn)必然聯(lián)系。每個血型系統(tǒng)的表現(xiàn)均存在地區(qū)差異，王志紅等人關于Rh系統(tǒng)的血清學研究中顯示[15]，Cc，cc抗原組合的標本可能出現(xiàn)D凝集強度減弱或者極弱形成弱D或者Del型，甚至D抗原不表達形成D陰性的現(xiàn)象，本室本次檢測則發(fā)現(xiàn)，在存在RHD（+）的等位基因但血清學實驗為RhD陰性的20例標本中，共有7例顯示為CC，排除地區(qū)差異，這提示江西地區(qū)的RHD基因與RHCE基因間的關系或可做更進一步研究。而隨著研究樣本數(shù)量的增加，我們將發(fā)現(xiàn)越來越多的D的基因型及分子背景，這對于安全輸血和遺傳學的研究都具有重要的價值。

所有研究的目的都是為臨床服務，本次檢測的111名RhD陰性的獻血者，其CcEe抗原的出現(xiàn)的頻率依次為 e（111/111）、c（106/111)、C(44/111)、E(6/111)，這提示隨著臨床輸血技術的提高，檢測Rh陰性獻血者的表型相當有必要，因為一旦患者產(chǎn)生抗-e，尋找合適的供血者將是非常艱難的，本次試驗還提示我們，D抗原的表達多種多樣，有不同的分子基礎，易與相關抗原互相影響，在日常工作中可能誤判，應當給予足夠重視，必要時采取基因?qū)W方法，確認正確的分型。