頭孢妥侖匹酯有關物質的合成及其結構確證

朱希 高浩凌 范鋼 盛力 沈大冬,*

(1 浙江省紹興市食品藥品檢驗研究院，紹興 312071；2 浙江醫藥股份有限公司研究院，紹興 312500)

頭孢妥侖匹酯(cefditoren pivoxil)是日本明治制果株式會社研制的第四代頭孢菌素類抗生素，具有廣泛的抗菌作用，尤其對葡萄球菌屬、肺炎鏈球菌等革蘭陽性菌、大腸埃希菌、卡他布蘭漢球菌、克雷伯菌屬、變形菌屬、流感嗜血菌等革蘭陰性菌以及消化鏈球菌屬、痤瘡丙酸桿菌、擬桿菌屬等厭氧菌有很強的抗菌力，其作用機制為抑制細菌細胞壁合成與各種細菌青霉素結合蛋白(PBP)的親和性高，發揮殺菌作用[1-2]。藥品中有關物質的種類和含量直接決定藥品的安全性，為確保安全性，就要求對藥品有關物質進行分析[3]。目前尚無文獻報道頭孢妥侖匹雜質的合成及其結構確證，僅有文獻[4-5]通過LC-MS對其雜質的分析，本研究在課題研究的基礎上[6-7]，根據美國藥典公布的頭孢妥侖匹酯的雜質譜[8]，通過化學法合成3個雜質(圖1)，并運用HMR、HRMS等分析方法對其結構進行詳解，為質量研究和控制提供參考依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：Agilent1260高效液相色譜(美國Agilent公司)、AgilentTechnologies 6520液質聯用儀(美國Agilent公司)、Bruker AvanceDMX400超導核磁共振儀(德國Bruker公司)、熔點儀(YRT-3，天大天發科技有限公司)。

圖1 雜質A、B、C的化學結構Fig.1 Chemical structure of the impurities A, B and C

試劑：7-氨基-3-(4-甲基噻唑基)-3-頭孢環-4-羧酸(自制)、頭孢妥侖匹酯(自制)、AE活性酯(百靈威科技有限公司)，其他試劑均為AR。

1.2 HPLC方法

色譜柱：YMC-Pack ODS-AM(150mm×4.6mm,5μm)；流動相為23mmol/L磷酸二氫鈉水溶液(磷酸調pH至3.0):甲醇:乙腈=2:1:1(V/V/V)；流速1.0mL/min；檢測波長為254nm；柱溫為30℃。

1.3 合成方法與結果

1.3.1 雜質A(頭孢妥侖酸鈉)的合成

反應瓶內加入THF(80mL)、7-氨基-3-(4-甲基噻唑基)-3-頭孢環-4-羧酸(5.00g, 14.5mmol)，室溫滴加5%NaHCO3(50mL)溶液，攪拌至溶解澄清，加入AE活性酯(5.58g, 15.9mmol)，室溫反應5h，滴加丙酮(110mL)，析出固體，過濾，用丙酮(50mL)洗濾餅，干燥得淺黃色固體A(6.40g，83.6%)，mp. 197～200℃(文獻[9]鈉鹽：195～200℃)，純度93.87%，HRMS，m/z：507.0578[M+H]+。

1.3.2 雜質B(Δ-3異構體)的合成

反應瓶中加入THF(50mL)、頭孢妥侖匹酯(5.00g, 8.1mmol)，攪拌溶解澄清后，加入濃氨水(2.0mL)，45℃油浴反應12h，硅膠柱層析純化(VDCM:VMeOH=20:1)得到2.4g粗品。粗品再由制備色譜柱分離提純，得到白色固體B(2.12g, 42.4%)，純度90.63%，HRMS，m/z：621.1254[M+H]+。

1.3.3 雜質C(特戊酰胺取代物)的合成

反應瓶中加入THF(50mL)、頭孢妥侖匹酯(5.00g, 8.1mmol)，室溫攪拌至溶解澄清，加入NaHCO3(2.30g)，N2置換保護，轉移至-10℃下，緩慢滴加特戊酰氯(2mL)，攪拌30min，室溫反應24h。加入純化水(200mL)，用乙酸乙酯(40mL×4)萃取，有機層用飽和食鹽水(20mL×2)洗滌，無水Na2SO4干燥，硅膠柱層析純化(VDCM:VMeOH=1:0～70:1)得到C(4.84g，84.7%)，純度95.38%，HRMS，m/z：705.1827[M+H]+。

2 結構確證

2.1 雜質A

外觀為淺黃色固體，HRMS顯示[M+H]+離子峰為507.0578，其熔點為197～200℃(文獻[9]鈉鹽：195～200℃)，推測分子式為C19H17N6O5S3Na。樣品的1H NMR顯示有17個氫[δ3.071(2H, dd)、δ1.193(2H, t)為雜質峰]，其中有3個氫[δ9.670(1H, d,J=8.0Hz)、δ7.242(2H, s)]經D2O交換消失，為活潑氫。13C NMR和DEPT135°顯示有19個碳[δ45.91、δ8.94為雜質峰]，其中9個伯碳或叔碳、1個仲碳、9個季碳(表1～2)。

COSY譜中，仲氨質子氫δ9.670(1H, d,J=8.0Hz)與δ5.844(1H, dd,J=3.6, 4.8Hz)相關，δ5.844(1H, dd,J=3.6, 4.8Hz)與δ5.247(1H, d,J=5.2Hz)相關，結合HSQC譜，因此可將δ5.844(1H, dd,J=3.6, 4.8Hz)、δ5.247(1H, d,J=5.2Hz)分別歸屬為H-6、H-7，δ59.24、δ58.06分別歸屬為C-6、C-7；HMBC譜中，仲氨質子氫與δ163.27相關，H-6和H-7與δ164.05相關，可將δ163.27、δ164.05分別歸屬為C-5、C-8。

表1 雜質A、B、C氫譜數據Tab. 1 1H NMR data of the impurities A, B and C

HMBC譜中，甲基氫δ2.371(3H, s)、δ8.940(1H,s)分別與δ126.54、δ152.55都相關，另一甲基氫δ3.840(3H, s)沒有相關的碳信號，可將δ2.371(3H,s)、δ8.940(1H, s)、δ3.840(3H, s)分別歸屬為H-17、H-16、H-19，結合HSQC譜可將δ15.74、δ153.49、δ62.38、δ126.54、δ152.55分別歸屬為C-17、C-16、C-19、C-14、C-15。

結合HSQC譜和COSY譜，仲碳(δ27.48)上的氫分裂為δ3.488(1H, d,J=10.4Hz)、δ3.338(1H, d,J=10.0Hz)，可歸屬為H-11，δ27.48歸屬為C-11。COSY譜中，δ6.349(1H, d,J=11.6Hz)和δ6.703(1H, d,J=12.0Hz)相關，HMBC譜中，δ6.703(1H, d,J=12.0Hz)與C-14、C-15，可將δ6.349(1H, d,J=11.6Hz)、δ6.703(1H, d,J=12.0Hz)分別歸屬為H-12、H-13，結合HSQC譜，δ128.17、δ121.54分別歸屬為C-12、C-13；H-11、H-12、H-13與δ126.28、δ126.67都相關，可將δ126.28、δ126.67分別歸屬為C-9、C-10。

剩余氫δ6.740(1H, s)可歸屬為H-2，結合HSQC譜，δ109.40歸屬為C-2；HMBC譜中，H-2與δ168.87、δ149.44、δ143.00相關，由于H-2與δ149.44相關信號較弱，C-1位連接氨基，可將δ168.87、δ149.44、δ143.00分別歸屬為C-1、C-4、C-3。

表2 雜質A、B、C碳譜數據Tab. 2 13C NMR data of the impurities A, B and C

2.2 雜質B

外觀為白色固體，HRMS顯示[M+H]+離子峰為621.1254，推測分子式為C25H28N6O7S3。樣品的1H NMR顯示有28個氫，其中有3個氫[δ8.016(1H, d,J=8.4Hz)、δ5.673(2H, s)]經D2O交換消失，為活潑氫。13C NMR和DEPT135°顯示有23個碳，其中11個伯碳或叔碳、1個仲碳、11個季碳，HSQC譜顯示δ1.172(9H, s)為單峰與δ26.78相關，可判斷叔丁基碳信號疊加，因此該分子共有25個碳(表1～2)。

由HSQC譜可將δ1.172(9H, s)歸屬為H-23、H-24、H-25，δ26.78歸屬為C-23、C-24、C-25；HMBC譜圖中，δ1.172(9H, s)與δ38.76、δ176.82相關，因羰基碳位于低場，可將δ38.76歸屬為C-22，δ176.82歸屬為C-21。仲碳δ80.34歸屬為C-20，δ5.757(2H, s)歸屬為C-20，再結合HSQC譜，δ5.757(2H, s)歸屬為H-20。

COSY譜中，仲氨質子氫δ8.016(1H, d,J=8.4Hz)與δ5.920(1H, t,J=4.4Hz)相關，δ5.920(1H, t,J=4.4Hz)與δ5.456(1H, s)相關，結合HSQC譜，因此可將δ5.920(1H, t,J=4.4Hz)、δ5.456(1H, s)分別歸屬為H-6、H-7，δ60.06、δ53.23分別歸屬為C-6、C-7；HMBC譜中，仲氨質子氫與δ162.54相關，H-6 和H-7與δ164.56相關，可將δ162.54、δ164.56分別歸屬為C-5、C-8。

HMBC譜中，δ2.442(3H, s)、δ8.423(1H, s)分別與δ126.12、δ153.86都相關，可將δ2.442(3H, s)、δ8.423(1H, s)分別歸屬為H-17、H-16，δ126.12、δ153.86分別歸屬為C-14、C-15；結合HSQC譜，可將δ15.65、δ151.43分別歸屬為C-17、C-16。

COSY譜中，δ5.955(1H, d,J=11.6Hz)與δ6.574(1H, d,J=11.2Hz)相關，結合HMBC譜，δ6.574(1H, d,J=11.2Hz)與C-14、C-15相關，可將δ5.955(1H, d,J=11.6Hz)、δ6.574(1H, d,J=11.2Hz)分別歸屬為H-12、H-13，結合HSQC譜，δ126.149、δ122.18分別歸屬為C-12、C-13。

HMBC譜中，C-12與δ4.962(1H, s)、δ6.415(1H,s)相關，δ4.962(1H, s)與低場碳δ165.84相關，可將δ4.962(1H, s)、δ6.415(1H, s)分別歸屬為H-9、H-11，δ165.84歸屬為C-18，結合HSQC譜，可將δ51.48、δ122.54分別歸屬為C-9、C-11。結合H-9和HMBC譜，可將δ118.98歸屬為C-10。

剩余的甲基氫δ4.016(3H, s)和δ6.802(1H, s)可分別歸屬為H-19、H-2，結合HSQC譜，可將δ63.12、δ111.77分別歸屬為C-19、C-2。HMBC譜中，C-2與δ168.25、δ142.34、δ147.29相關，C-1上連接氨基，可將低場碳δ168.25歸屬為C-1，由于C-2與δ142.34相關信號較強，因此可將δ142.34、δ147.29分別歸屬為C-3、C-4。

2.3 雜質C

外觀為白色固體，HRMS顯示[M+H]+離子峰為705.1827，推測分子式為C30H36N6O8S3。樣品的1H NMR顯示有36個氫，其中有2個氫[δ7.537(1H, d,J=8.4Hz)、δ9.514(1H, s)]經D2O交換消失，為活潑氫。13C NMR和DEPT135°顯示有26個碳，其中12個伯碳或叔碳、2個仲碳、12個季碳，HSQC譜顯示δ1.318(9H, s)、δ1.147(9H, s)為單峰分別與δ27.07、δ26.75相關，可判斷叔丁基碳信號疊加，因此該分子共有30個碳(表1～2)。

HMBC譜中，δ1.318(9H, s)與δ176.69、δ39.21相關，δ1.147(9H, s)與δ176.82、δ39.21相關，仲碳δ5.829(2H, dd,J=5.2, 5.6Hz)與δ176.82、δ159.99相關，可將δ1.318(9H, s)歸屬為H-28、H-29、H-30，δ1.147(9H, s)歸屬為H-23、H-24、 H-25，δ176.82、δ176.69、δ159.99、δ39.21、δ39.21分別歸屬為C-21、C-26、C-18、C-27、C-21；結合HSQC譜，δ26.75歸屬為C-23、C-24、 C-25，δ27.07歸屬為C-28、C-29、 C-30。

COSY譜中，仲氨質子氫δ7.573(1H, d,J=8.4Hz)與δ6.078(1H, dd,J=4.0, 4.8Hz)相關，δ6.078(1H, dd,J=4.0, 4.8Hz)與δ5.221(1H, d,J=5.2Hz)相關，結合HSQC譜，因此可將δ6.078(1H, dd,J=4.0, 4.8Hz)、δ5.221(1H, d,J=5.2Hz)分別歸屬為H-6、H-7，δ59.21、δ57.58分別歸屬為C-6、C-7；HMBC譜中，仲氨質子氫δ7.573(1H, d,J=8.4Hz)與δ162.32相關，H-6 和H-7與δ164.15相關，可將δ162.32、δ164.15分別歸屬為C-5、C-8。

HMBC譜中，甲基氫δ2.442(3H, s)、δ6.665(1H, d,J=11.6Hz)、δ8.615(1H, s)分別與δ125.86、δ153.14都相關，COSY譜中，δ6.363(1H, d,J=11.6Hz)與δ6.665(1H,d,J=11.6Hz)相關，因此可將δ2.442(3H, s)、δ6.363(1H,d,J=11.6Hz)、δ6.665(1H, d,J=11.6Hz)、δ8.615(1H,s)分別歸屬為H-17、H-12、H-13、H-16，δ125.86、δ153.14分別歸屬為C-14、C-15；結合HSQC譜，可將δ15.54、δ126.44、δ122.24、δ152.17分別歸屬為C-17、C-12、C-13、C-16。

結合HSQC譜和COSY譜，仲碳(δ28.20)上的氫分裂為δ3.295(1H, d,J=18.8Hz)、δ3.518(1H, d,J=19.2Hz)，可歸屬為H-11，δ27.48歸屬為C-11。HMBC譜中，H-11與δ124.88、δ130.30相關，H-12與δ124.88相關，H-13與δ130.30相關，可將δ124.88、δ130.30分別歸屬為C-9、C-10。

剩余氫δ7.258(1H, s)可歸屬為H-2，結合HSQC譜，δ116.63歸屬為C-2；HMBC譜中，H-2與δ158.97、δ147.19、δ140.81相關，由于H-2與δ147.19相關信號較弱，C-1位連接酰胺基，可將δ158.97、δ147.19、δ140.81分別歸屬為C-1、C-4、C-3。

3 討論

頭孢妥侖匹酯是臨床上應用較廣的抗生素，其有關物質非常復雜，僅美國藥典公布的雜質譜就超過10個，目前除少數幾種工藝雜質外，大多數雜質尚未對其進行結構確證，因此制備各種有關物質并進行確證對提高頭孢妥侖匹酯的質量及其控制至關重要。本研究利用化學法合成得到3個雜質：頭孢妥侖酸鈉、Δ-3異構體、特戊酰胺取代物，并運用一維和二維核磁共振、質譜等檢測方法對其碳氫信號進行了詳細的解析和歸屬，為頭孢妥侖匹酯的雜質研究和質量控制提供了參考。