胍丁胺的柱前衍生方法及評(píng)價(jià)

周 娟，張惠靜，胡嵐嵐 綜述，湯建林△ 審校

(1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院臨床藥理基地，重慶 400037；2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析與分析化學(xué)教研室，重慶 400038)

胍丁胺是精氨酸脫羧基生成的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物、細(xì)菌及哺乳類動(dòng)物的各種組織中。研究表明，胍丁胺生物學(xué)作用豐富，內(nèi)源性胍丁胺及其相應(yīng)的受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)構(gòu)成了阿片功能的調(diào)節(jié)系統(tǒng)[1]；外源性胍丁胺的初步藥理學(xué)研究證明，胍丁胺能增強(qiáng)嗎啡鎮(zhèn)痛[2]，降低其成癮性及抗耐受作用[3-4]，而且抗抑郁[5-6]和抗焦慮[7]作用明顯，具有良好的研究及應(yīng)用前景[8]。胍丁胺極性強(qiáng)、相對(duì)分子質(zhì)量小，其結(jié)構(gòu)中無(wú)紫外和熒光吸收基團(tuán)，難以氣化，且內(nèi)源性胍丁胺含量低，生物樣品中干擾成分較多，一般方法難以檢測(cè)[9]，因此，對(duì)胍丁胺的定量測(cè)定成為研究胍丁胺生物學(xué)作用亟待解決的重要問(wèn)題。近年來(lái)，通過(guò)衍生化作用改變胍丁胺的極性，增大其在色譜柱上的保留，并增大分析物的相對(duì)分子質(zhì)量，使之與內(nèi)源性小分子雜質(zhì)分離[10]，實(shí)現(xiàn)內(nèi)源性胍丁胺的定量測(cè)定。胍丁胺的柱前衍生定量分析方法主要有柱前衍生化高效液相色譜法(HPLC)、柱前衍生化氣相色譜法、柱前衍生化色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等，這些方法各具特點(diǎn)，因而適用范圍各不相同。目前，常用的衍生化試劑包括鄰苯二甲醛(OPA)類，該試劑與胍丁胺衍生需要巰基試劑的參與，常用的巰基試劑包括巰基乙醇(ME)[11]、巰基丙酸(3-MPA)[12]、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)[13]，以及2,3-萘二甲醛(NDA)[14]、4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并氧雜噁二唑(NBD-F)[15]、氯甲酸-9-芴基甲酯(FMOC-Cl)[16]、乙酰丙酮(AA)類[如三氟乙酰丙酮(TFAA)、六氟乙酰丙酮(HFAA)[17]等]。本文對(duì)胍丁胺近年來(lái)常用的柱前衍生化試劑進(jìn)行了總結(jié)，并對(duì)各種衍生試劑的優(yōu)缺點(diǎn)、最佳衍生條件及檢測(cè)方法做了比較全面地分析，旨在為后期測(cè)定胍丁胺的含量及生物學(xué)研究提供方法與思路。

1 OPA

OPA是目前應(yīng)用最為廣泛的衍生化試劑，在巰基試劑(如ME、3-MPA、NAC等)的作用下胍丁胺和OPA迅速反應(yīng)生成具有較強(qiáng)熒光的異吲哚衍生物，見(jiàn)圖1。該反應(yīng)所需條件較溫和(室溫、堿性)，反應(yīng)迅速，樣品制備簡(jiǎn)單，適用于大量生物樣品的分析測(cè)定。

圖1 胍丁胺與OPA類衍生試劑的反應(yīng)方程式

1997年FENG等[11]首次利用OPA-ME作為胍丁胺柱前衍生化試劑，通過(guò)HPLC熒光檢測(cè)器測(cè)定大鼠腦內(nèi)及人血漿中胍丁胺的水平。文獻(xiàn)中將50 mg的OPA溶解在1 mL甲醇中，加入53 μL的ME和9 mL的硼酸鉀緩沖溶液(0.2 mol/L，pH=9.4)混勻，于4 ℃冰箱放置不超過(guò)3 d。衍生過(guò)程取15 μL的樣品和15 μL的OPA-ME衍生試劑在室溫條件下混合反應(yīng)2 min，后立即取20 μL進(jìn)樣分析。該方法選擇同型半胱氨酸為內(nèi)標(biāo)，靈敏度高，檢出限為0.1 pmol/L。該方法中單一樣本檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)(t=80 min)，因此，并不適合用于常規(guī)檢測(cè)。蘇瑞斌等[18]利用OPA-ME柱前衍生化HPLC熒光檢測(cè)法測(cè)定大鼠不同腦區(qū)及NG-108-15細(xì)胞內(nèi)胍丁胺的含量。結(jié)果顯示正常大鼠不同腦區(qū)和NG108-15細(xì)胞內(nèi)胍丁胺的含量分別為0.80～1.71 μg/g濕腦組織、0.044 mg/g蛋白。宋滇文等[19]選擇微量OPA-ME柱前衍生技術(shù)，通過(guò)熒光檢測(cè)器測(cè)定大鼠脊髓組織中胍丁胺的含量，檢測(cè)限可達(dá)到3.85 pmol/L。目前OPA-ME作為胺類化合物柱前衍生試劑應(yīng)用廣泛，但是OPA-ME在反相柱分離過(guò)程中部分衍生化合物會(huì)發(fā)生裂解，因此，必須嚴(yán)格控制衍生化反應(yīng)的時(shí)間。

相關(guān)文獻(xiàn)表明，OPA-3-MPA與多胺的衍生反應(yīng)迅速(<5 min)，且具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度。MARKOWSKI等[12]使用OPA-3-MPA進(jìn)行柱前衍生，通過(guò)HPLC熒光檢測(cè)器(λex=338 nm，λem=455 nm)測(cè)定人體尿液中精氨酸及胍丁胺在內(nèi)的12種代謝產(chǎn)物。方法中稱取40 mg OPA溶解在0.8 mL甲醇中，加入40 μL的3-MPA和7.2 mL硼酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L，pH=9.0)混勻，于黑暗低溫中保存不超過(guò)2 d。將制備好的50 μL樣品與50 μL的OPA-3-MPA衍生試劑渦旋混合，室溫下精確反應(yīng)2 min，立即取20 μL注入HPLC熒光測(cè)定系統(tǒng)中，胍丁胺的檢出限為28 nmol/L，保留時(shí)間為44 min。

多胺可以與OPA和NAC反應(yīng)形成相對(duì)穩(wěn)定的衍生產(chǎn)物，即OPA-NAC-多胺。DAI等[13]采用HPLC熒光檢測(cè)器，以O(shè)PA-NAC作為柱前衍生化試劑，測(cè)定豬肝臟、空腸、回腸等組織中的胍丁胺含量。試驗(yàn)中稱取50 mg OPA和50 mg NAC溶解于1.25 mL甲醇中，加入40 mmol/L硼酸鈉緩沖液(pH 9.5)11.2 mL和0.4 mL Brij@-35，輕輕混勻。該衍生試劑須在HPLC分析當(dāng)天新鮮配制，并避光儲(chǔ)存在4 ℃，24 h內(nèi)使用。此方法特異性強(qiáng)，不受氨基酸的干擾，胍丁胺的保留時(shí)間約為9 min，檢測(cè)限為0.5 nmol/mL或0.1 nmol/mg生物樣品組織，且衍生化溶液中使用的OPA對(duì)HPLC系統(tǒng)沒(méi)有不利影響。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，與含有氨基或胺基的物質(zhì)發(fā)生快速衍生化反應(yīng)最佳的OPA濃度為1.95 mg/mL或14.5 mmol/L。OPA-NAC衍生化反應(yīng)具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏、重現(xiàn)型好等特點(diǎn)，可用于在線自動(dòng)化柱前衍生，消除了手工操作中的錯(cuò)誤，從而縮短反應(yīng)產(chǎn)物形成到熒光檢測(cè)之間的時(shí)間間隔，適合各種不同特性的生物樣品和小體積/小量的衍生化反應(yīng)，適用于農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究多胺的精確分析[20]。

2 NDA

NDA與胍丁胺在氰化物存在下反應(yīng)簡(jiǎn)單快速，且衍生產(chǎn)物非常穩(wěn)定，見(jiàn)圖2。ROBERTS等[14]利用NDA柱前衍生HPLC熒光法測(cè)定小鼠脊髓給予胍丁胺后的藥效學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)研究，實(shí)驗(yàn)中將組織提取物真空濃縮并懸浮于100 μL pH=9.4的硼酸鹽緩沖液中；加入NaCN(40 μL，0.025 mol/L)，然后加入甲醇配制的萘二甲醛(100 μL，0.05 mol/L)，在室溫下反應(yīng)20 min，取5～10 μL反應(yīng)混合溶液進(jìn)樣。CHEN等[21]通過(guò)NDA柱前衍生化毛細(xì)管電泳結(jié)合發(fā)光二極管誘導(dǎo)熒光檢測(cè)(CE-LEDIF)法分離啤酒樣品中的氨基酸和胺，檢測(cè)到胍丁胺濃度為87.4 μmol/L。另外，ZHAO等[15]認(rèn)為用NDA衍生胍丁胺其衍生產(chǎn)物對(duì)熱穩(wěn)定，且具有激光誘導(dǎo)熒光(LIF)檢測(cè)有利的檢測(cè)波長(zhǎng)(λex=447 nm，λem=520 nm)，但柱子對(duì)衍生物和過(guò)多的NDA保留極強(qiáng)，難以洗脫。

3 NBD-F

熒光標(biāo)記試劑NBD-F用于柱前衍生化，所得到的衍生產(chǎn)物具有高的光穩(wěn)定性和有利的最大激發(fā)波長(zhǎng)(480 nm，接近氬離子激光發(fā)射器的激發(fā)波長(zhǎng)488 nm)，因此可用激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器(LIF)進(jìn)行檢測(cè)。ZHAO等[15]利用NBD-F作為柱前衍生化試劑結(jié)合LIF檢測(cè)鼠腦、胃組織及人血漿中胍丁胺的含量反應(yīng)方程見(jiàn)圖3，檢出限為5 nmol/L，檢測(cè)時(shí)間<10 min。研究中指出，NBD-F與胍丁胺的衍生化反應(yīng)需在一定溫度下進(jìn)行，如堿性環(huán)境下(pH=8.5)、溫度T=60 ℃時(shí)，反應(yīng)時(shí)間為40 min。室溫條件下該衍生產(chǎn)物存放2 h仍保持穩(wěn)定，經(jīng)乙酸乙酯萃取后，于4 ℃冰箱可穩(wěn)定保存數(shù)月。另外，文獻(xiàn)中提到，NBD-F的濃度直接影響衍生物產(chǎn)量，當(dāng)NBD-F與胍丁胺的比例大于120∶1時(shí)，熒光信號(hào)最大。用NBD-F衍生胍丁胺的有效pH范圍為8.3～9.5，在溶液pH>9.5時(shí)，NBD-F將會(huì)發(fā)生明顯的水解反應(yīng)，從而導(dǎo)致色譜峰拖尾嚴(yán)重。PAULSON等[22]采用超高效液相-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-ESI-MS)，以NBD-F作為柱前衍生試劑測(cè)定肺囊性纖維化患者痰樣本中胍丁胺的含量，其檢測(cè)限為40 nmol/L。總之，NBD-F衍生胍丁胺反應(yīng)穩(wěn)定，且熒光強(qiáng)度適宜，靈敏度高，可用于精確定性定量分析。但是由于該方法需要LIF或質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，一般實(shí)驗(yàn)室無(wú)法普及。

圖2 胍丁胺與NDA類衍生試劑的反應(yīng)方程式

圖3 胍丁胺與NBD-F的反應(yīng)方程式

4 FMOC-Cl

FMOC-Cl能與伯胺、仲胺在介質(zhì)pH 8.5～9.5發(fā)生反應(yīng)，該衍生過(guò)程速度快、產(chǎn)物穩(wěn)定、熒光強(qiáng)度高、靈敏度高，是一種較為理想的氨基酸定量分析的柱前衍生化試劑。BAUZA等[16]利用FMOC-Cl柱前衍生HPLC法測(cè)定白葡萄酒中5種氨基酸和8種胺類物質(zhì)的含量，在20 μL白葡萄酒樣品中加入50 μL緩沖溶液(pH=8.5)和100 μL FMOC試劑(8 mg FMOC/1 mL ACN)反應(yīng)3 min后，加入300 μL淬滅劑(乙腈-乙酸-水，比例為20∶2∶3)。該方法檢測(cè)得到胍丁胺的含量為4.1 mg/L。然而，F(xiàn)MOC衍生有一個(gè)眾所周知的缺點(diǎn)，即寬試劑峰[FMOC-Cl和(或)FMOC-OH]的干擾效應(yīng)。為了消除寬試劑峰的干擾，KIRSCHBAUM等[23]對(duì)衍生試劑用量、淬滅試劑最佳需要量及定量反應(yīng)的最佳時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，衍生過(guò)程中高濃度的FMOC-Cl衍生試劑和過(guò)量的淬滅試劑沒(méi)有辦法定量消除，氨基酸與FMOC-Cl的最佳反應(yīng)時(shí)間為3 min，而對(duì)于具有較低反應(yīng)速率的胺最佳反應(yīng)時(shí)間為5 min。

5 AA

胍丁胺由于結(jié)構(gòu)中沒(méi)有吸收基團(tuán)，難以氣化，較難檢測(cè)。丘忠麗等[17]以HFAA作為胍丁胺的衍生試劑，采用同位素稀釋-氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)大鼠血漿中的內(nèi)源性胍丁胺，檢出限為0.005 7 ng/mL。與同類衍生試劑AA、TFAA相比，HFAA衍生胍丁胺產(chǎn)率更高，且衍生產(chǎn)物最穩(wěn)定、揮發(fā)度高(氣化溫度降低)，從而促進(jìn)了胍丁胺在氣相色譜(GC)上獲得較好的分離和檢測(cè)。DOUGLAS等[24]利用該反應(yīng)產(chǎn)物成環(huán)具有高度揮發(fā)性和良好的電捕獲能力，通過(guò)負(fù)化學(xué)電離質(zhì)譜(GC-NCI-MS)檢測(cè)鼠腦組織中的胍丁胺，保留時(shí)間為2 min，檢出限為25 fmol/L。但是該方法樣品前處理較為復(fù)雜，需經(jīng)過(guò)2次液液萃取。另外,阮志鵬[25]應(yīng)用HFAA作衍生試劑，乙酸乙酯作催化劑，通過(guò)氣相色譜氮磷檢測(cè)器(GC-NPD)分析大鼠血漿中的胍丁胺濃度，其最低檢測(cè)濃度為0.1 μg/mL，可用于胍丁胺的血藥濃度分析及藥代動(dòng)力學(xué)研究。

6 小 結(jié)

隨著內(nèi)源性胍丁胺的生物學(xué)作用日益被廣泛關(guān)注，以及外源性胍丁胺可能具有良好的新藥開(kāi)發(fā)前景和價(jià)值，胍丁胺衍生化高特異度與靈敏度的定量檢測(cè)方法的建立成為眾多研究者關(guān)注的重點(diǎn)。分析發(fā)現(xiàn)，各衍生試劑與胍丁胺反應(yīng)的條件不同，生成的化合物穩(wěn)定性、熒光強(qiáng)度亦有明顯差異，筆者總結(jié)了幾種常用的衍生試劑與胍丁胺發(fā)生衍生反應(yīng)的條件，見(jiàn)表1。

表1 不同衍生試劑與胍丁胺衍生的條件

注：-表示無(wú)此項(xiàng)

目前，柱前衍生化色譜/質(zhì)譜技術(shù)廣泛應(yīng)用于樣品中胍丁胺的檢測(cè)，常用衍生試劑包括OPA、NDA、NBD-F、FMOC-Cl等。OPA類衍生試劑與胍丁胺反應(yīng)快速、簡(jiǎn)單，過(guò)量的衍生試劑對(duì)檢測(cè)不產(chǎn)生干擾，衍生產(chǎn)物具有高度熒光。但是該類衍生試劑不與次級(jí)氨基酸發(fā)生反應(yīng)；衍生試劑不穩(wěn)定，通常只能保存1～2 d，臨用時(shí)須新鮮配制；衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性相對(duì)較差，限制了樣品預(yù)處理程序的使用，如樣品清潔和預(yù)濃縮。NDA與伯胺在氰化物存在下反應(yīng)簡(jiǎn)單快速，且衍生產(chǎn)物非常穩(wěn)定，但柱子對(duì)衍生物和過(guò)多的NDA保留極強(qiáng)，難以洗脫。NBD-F與胍丁胺反應(yīng)衍生產(chǎn)物較單一，雜質(zhì)干擾少，具有極佳的光穩(wěn)定性。當(dāng)溶液pH>9.5時(shí)，NBD-F將會(huì)發(fā)生明顯的水解反應(yīng)，導(dǎo)致色譜峰嚴(yán)重拖尾，所以需嚴(yán)格控制溶液的pH。FMOC-Cl能與伯胺和仲胺發(fā)生快速反應(yīng)，衍生產(chǎn)物穩(wěn)定，熒光強(qiáng)度高，靈敏度高。然而，F(xiàn)MOC-Cl不僅和氨基酸會(huì)發(fā)生多重衍生反應(yīng)，而且易形成寬試劑峰干擾氨基酸分離，衍生過(guò)程中高濃度的FMOC-Cl和過(guò)量的淬滅試劑較難定量消除。HFAA與胍丁胺反應(yīng)衍生物產(chǎn)率高、易揮發(fā)且穩(wěn)定，但反應(yīng)條件苛刻，需要較高溫度和較長(zhǎng)時(shí)間。在實(shí)際胍丁胺測(cè)定過(guò)程中選擇衍生試劑需要根據(jù)自身試驗(yàn)需要，綜合考慮衍生試劑是否容易獲得、穩(wěn)定性、衍生反應(yīng)的快慢以及衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性、靈敏度、檢測(cè)限等。只有充分了解這些衍生試劑的特點(diǎn)，才能做出正確的選擇，從而獲得理想的測(cè)定結(jié)果。