GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)在檢測(cè)利福平耐藥及耐多藥結(jié)核中的應(yīng)用評(píng)價(jià)

陳 軍，陳麗峰，任 易，饒有益，余 堅(jiān)，劉 暢，肖 勇，袁保東

(武漢市肺科醫(yī)院/武漢市結(jié)核病防治所：1.檢驗(yàn)科；2.結(jié)核科，湖北武漢 430030)

結(jié)核分枝桿菌對(duì)抗結(jié)核藥物的耐藥是結(jié)核病控制的主要威脅之一。耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)是指結(jié)核病患者感染的結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗(yàn)證實(shí)至少同時(shí)對(duì)異煙肼和利福平耐藥的結(jié)核病。而廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)是指結(jié)核病患者感染的結(jié)核分枝桿菌體外藥敏試驗(yàn)證實(shí)至少同時(shí)對(duì)異煙肼和利福平耐藥外，還對(duì)任何氟喹諾酮類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥，以及3種二線注射類藥物(卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星)中的至少1種耐藥的結(jié)核病。MDR-TB和XDR-TB的出現(xiàn)使得結(jié)核病流行勢(shì)態(tài)更為嚴(yán)峻，明顯影響治療的效果。

我國(guó)傳統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的方法主要是涂片抗酸染色、羅氏培養(yǎng)和比例法藥敏試驗(yàn)。抗酸染色鏡檢方法的陽(yáng)性檢出率低，而羅氏培養(yǎng)和藥敏方法耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，需2～3個(gè)月，均不能滿足臨床快速診斷和藥敏的需要。GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱Xpert)由美國(guó)Cepheid公司研發(fā)，是目前世界上唯一將DNA提取、PCR擴(kuò)增和熒光檢測(cè)結(jié)合在一起，并自動(dòng)進(jìn)行結(jié)果報(bào)告的檢測(cè)系統(tǒng)。該系統(tǒng)采用半巢式PCR，針對(duì)rpoB基因81 bp利福平耐藥決定區(qū)(RRDR)設(shè)計(jì)了5個(gè)分子信標(biāo)探針(以探針A、B、C、D、E命名)，以檢測(cè)是否有結(jié)核分枝桿菌，以及對(duì)利福平是否耐藥，同時(shí)以球芽孢桿菌(SPC)為內(nèi)對(duì)照，以判斷DNA擴(kuò)增是否存在抑制[1]。Xpert不僅能用于結(jié)核的診斷，同時(shí)能獲得利福平是否耐藥，對(duì)結(jié)核病的早期診斷及控制MDR-TB的傳播有重要意義。國(guó)內(nèi)外關(guān)于Xpert在結(jié)核病診斷及利福平耐藥報(bào)道較多[2-5]，但關(guān)于Xpert在耐多藥結(jié)核的應(yīng)用評(píng)價(jià)，因試劑成本相對(duì)較高和樣本量較少而報(bào)道不多。本研究收集了本院檢驗(yàn)科自2014年1月開(kāi)展Xpert以來(lái)，在本院就診且Xpert與培養(yǎng)均陽(yáng)性的1 300例結(jié)核病患者，探討Xpert在檢測(cè)利福平耐藥及MDR-TB的應(yīng)用價(jià)值，并進(jìn)一步分析Xpert與比例法利福平藥敏結(jié)果不一致的原因。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 收集2014年1月至2016年6月武漢市結(jié)核病防治所門診及病區(qū)送檢的各類標(biāo)本共4 263例，包括痰、支氣管肺泡灌洗液、胸腹水、腦脊液、尿液、病理組織及穿刺物進(jìn)行Xpert檢測(cè)、分枝桿菌培養(yǎng)，培養(yǎng)陽(yáng)性菌株進(jìn)行比例法藥敏試驗(yàn)。對(duì)Xpert與比例法檢測(cè)利福平藥敏結(jié)果不一致的菌株進(jìn)行rpoB基因的RRDR區(qū)測(cè)序和最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定。羅氏培養(yǎng)基分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性1 359例，Xpert檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性1 662例，培養(yǎng)陽(yáng)性而Xpert陰性59例(36例為非結(jié)核分枝桿菌),Xpert與培養(yǎng)均陽(yáng)性的標(biāo)本1 300例，均來(lái)自不同患者標(biāo)本，剔除同一患者重復(fù)送檢標(biāo)本。對(duì)1 300例Xpert與培養(yǎng)均陽(yáng)性的標(biāo)本納入分析。本研究經(jīng)武漢市結(jié)核病防治所倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 Xpert檢測(cè)系統(tǒng)及其配套試劑盒，由美國(guó)Cepheid公司提供。酸性羅氏培養(yǎng)基由檢驗(yàn)科自制。中性羅氏培養(yǎng)基、異煙肼、利福平藥敏培養(yǎng)基及對(duì)硝基苯甲酸(PNB)培養(yǎng)基購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)公司。7H9干粉和OADC均購(gòu)自Difco公司。結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(H37Rv，ATCC27294)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.3方法

1.3.1羅氏固體培養(yǎng) 于痰、纖維支氣管鏡灌洗液、膿汁等標(biāo)本加入等量4%的氫氧化鈉，組織標(biāo)本用勻漿器勻漿后加適量4%的氫氧化鈉，振蕩?kù)o置20 min，無(wú)菌吸管吸取0.1 mL接種到酸性羅氏培養(yǎng)基上，胸腹水，腦脊液離心取沉淀直接接種中性羅氏培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第3天及每周觀察記錄結(jié)果，陰性培養(yǎng)至第56天。

1.3.2羅氏培養(yǎng)基藥敏比例法 按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[6]進(jìn)行。利福平、異煙肼的終濃度分別為40.0 μg/mL、0.2 μg/mL。

1.3.3利福平MIC測(cè)定 在專用超聲分散管中加入2.0 mL生理鹽水，取臨床分離的2～3周菌齡的新鮮培養(yǎng)物一環(huán)于分散管中，在超聲分散儀中超聲分散1 min自動(dòng)比濁，用生理鹽水稀釋成1號(hào)麥?zhǔn)媳葷峁艿臐岫龋磁涑? mg/mL的菌懸液。將菌懸液用7H9-S肉湯進(jìn)行20倍稀釋。在96孔無(wú)菌平板中，向第1～8孔各加入100 μL的7H9-S肉湯，將100 μL利福平原液(32.0 μg/mL)加入第1孔，將第1孔混勻后取100 μL，進(jìn)行連續(xù)2倍稀釋至第8孔，第9孔為無(wú)抗菌藥物的陽(yáng)性對(duì)照。第10孔為培養(yǎng)基無(wú)菌對(duì)照。第1～9孔每孔加應(yīng)用菌懸液100 μL。酶標(biāo)板用封板紙密封，放入濕盒內(nèi)，在37 ℃孵育5 d，在第6天，加入30 μL的經(jīng)過(guò)濾除菌的0.1 g/L刃天青顯色液，繼續(xù)孵育24 h，如第9孔變成粉紅色，則加刃天青顯色液至其他各孔，再孵育24 h，記錄顏色結(jié)果。如果第9孔仍為蘭色，分別在第9、11天觀察。MIC定義為仍然保持蘭色的最低的抗菌藥物濃度。

1.3.4Xpert檢測(cè) 按試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作。Xpert對(duì)結(jié)核分枝桿菌的結(jié)果分為：結(jié)核分枝桿菌檢出(極低、低、中、高)和未檢出。Ct指探針循環(huán)閾值，ΔCt指探針早期Ct值與晚期Ct值之差。Xpert對(duì)利福平耐藥的檢測(cè)結(jié)果分為：利福平resistance檢出，ΔCt>3.5，對(duì)利福平耐藥；利福平resistance未檢出，ΔCt≤3.5，對(duì)利福平敏感。

1.3.5細(xì)菌DNA提取 用接種環(huán)刮取一環(huán)菌落至含1.0 mL生理鹽水的微量離心管。高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司,5417R)6 000×g離心10 min。在生物安全柜中打開(kāi)離心管，去上清，加入無(wú)菌生理鹽水洗滌1次，6 000×g離心10 min。沉淀直接加入200 μL DNA提取液(上海生工生物工程公司)充分震蕩混勻，將EP管置于干式恒溫器中(100 ℃，10 min)，然后轉(zhuǎn)至4 ℃靜置6～8 h保證充分裂解。

1.3.6rpoB基因擴(kuò)增與測(cè)序 用于擴(kuò)增rpoB基因81 bp RRDR區(qū)的引物序列F 5′-CCA CCC AGG ACG TGG AGG CGA TCA CAC CG-3′、R 5′-CGT TTC GAT GAA CCC GAA CGG GTT GAC-3′[7]由上海生工生物工程公司合成。擴(kuò)增片段大小為329 bp。擴(kuò)增主要包括rpoB基因與利福平耐藥相關(guān)的507～533位點(diǎn)。反應(yīng)體系為30 μL：PCR MIX(2×) (Fermentas公司)15 μL，2 μmol/L上下游引物3 μL，滅菌蒸餾水10 μL， DNA模板2 μL。5 000×g離心片刻，置PCR擴(kuò)增儀(杭州博日公司，LifeTouch TC96)中，擴(kuò)增條件如下：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 35 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。rpoB基因測(cè)序由上海生工生物工程公司完成。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 建立Excel工作表收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，運(yùn)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用百分比表示，統(tǒng)計(jì)分析采用四格表的χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩種方法一致性比較采用Kappa檢驗(yàn)，Kappa值>0.75為優(yōu)。

2 結(jié) 果

2.11 300例培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平和異煙肼比例法藥敏結(jié)果 1 300株結(jié)核分枝桿菌菌株中，比例法藥敏結(jié)果為1 011株對(duì)利福平敏感，289株對(duì)利福平耐藥；962株對(duì)異煙肼敏感，338株對(duì)異煙肼耐藥。MDR-TB為241株。

2.2Xpert和比例法利福平藥敏結(jié)果比較 在1 300例培養(yǎng)陽(yáng)性的標(biāo)本中，Xpert檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性，利福平耐藥未檢出的標(biāo)本991株，利福平耐藥檢出的標(biāo)本309株。二者均敏感為989株，均耐藥為287株，比例法敏感而Xpert耐藥為22株，比例法耐藥而Xpert敏感為2株。以比例法為“金標(biāo)準(zhǔn)”，Xpert檢出利福平耐藥的靈敏度為99.31%，特異度為97.82%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為92.88%，陰性預(yù)測(cè)值為99.80%，總符合率為98.15%，Kappa值=0.948。

2.3Xpert與比例法利福平藥敏結(jié)果不一致的菌株測(cè)序及利福平MIC測(cè)定 在22株比例法敏感而Xpert檢出耐藥的菌株中，6株在RRDR區(qū)未檢測(cè)到突變；16株在RRDR區(qū)檢測(cè)到突變，其中8株為L(zhǎng)511P突變，MIC在0.125～0.500 μg/mL；4株為L(zhǎng)533P突變，MIC均為0.500 μg/mL；1株為沉默突變，MIC為0.060 μg/mL；1株為D516Y突變，MIC為1.000 μg/mL；1株為F518C、L533P雙位點(diǎn)突變，MIC為2.000 μg/mL；1株為D516Y、F518D雙位點(diǎn)突變，MIC為0.500 μg/mL。在2株比例法耐藥而Xpert為敏感的菌株中，1株在RRDR區(qū)未檢測(cè)到突變，MIC為0.500 μg/mL；1株在RRDR區(qū)外存在E546G突變，MIC為8.000 μg/mL。見(jiàn)表1。

表1 24株Xpert與比例法利福平藥敏不一致菌株的RRDR測(cè)序及MIC結(jié)果

續(xù)表1 24株Xpert與比例法利福平藥敏不一致菌株的RRDR測(cè)序及MIC結(jié)果

注：SP為痰液；BALF為支氣管肺泡灌洗液；S為敏感；R為耐藥；-表示無(wú)此項(xiàng)

2.4不同治療類型患者利福平耐藥突變探針的檢出比例 309例患者利福平耐藥突變檢出的探針?lè)植记闆r見(jiàn)表2。

表2 309例患者利福平耐藥突變檢出的探針比例[n(%)]

表3 利福平耐藥突變檢出的309例患者對(duì)應(yīng)菌株的比例法藥敏結(jié)果[n(%)]

注：R為利福平；H為異煙肼

2.5利福平耐藥突變檢出的309例患者對(duì)應(yīng)菌株的比例法藥敏結(jié)果 在利福平耐藥突變檢出的309例患者中，MDR-TB為239例，其中初治為94例，復(fù)治為145例。初復(fù)治患者中，雖然復(fù)治患者M(jìn)DR-TB的占比比初治患者稍高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.552，P=0.458)。309例患者對(duì)應(yīng)菌株的表型藥敏結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討 論

利福平通過(guò)與結(jié)核分枝桿菌DNA依賴的RNA聚合酶β亞單位結(jié)合而阻止該酶與合成RNA的底物三磷酸核苷結(jié)合，阻斷RNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程，使RNA和蛋白的合成停止，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。RNA聚合酶的β亞單位由rpoB基因編碼，結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平耐藥主要因?yàn)閞poB基因發(fā)生突變所致。這些改變主要是集中在rpoB中的81個(gè)堿基區(qū)域(利福平耐藥決定區(qū))內(nèi)的各種突變，也有少量堿基插入或缺失。95%以上的利福平耐藥與rpoB基因突變有關(guān)。本研究以比例法藥敏為“金標(biāo)準(zhǔn)”，Xpert利福平耐藥檢出的靈敏度為99.31%，特異度為97.82%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為92.88%，陰性預(yù)測(cè)值為99.80%，Xpert與比例法藥敏的一致性為優(yōu)(Kappa值=0.948)，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道相一致[5,8]。如果以測(cè)序結(jié)果(22例比例法敏感的菌株中16例均檢測(cè)到突變)進(jìn)行較正，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值從92.88%提高到98.06%。說(shuō)明表型藥敏可能會(huì)導(dǎo)致部分低度耐藥菌漏檢，分子檢測(cè)手段一定程度彌補(bǔ)了表型檢測(cè)的不足。

在22例表型敏感而Xpert利福平耐藥檢出不一致的標(biāo)本中，分離菌株經(jīng)基因測(cè)序有16株檢測(cè)出突變，6株未檢出突變。突變以有爭(zhēng)議的L511P、L533P檢出為主，這2個(gè)位點(diǎn)突變?cè)诒硇退幟糁卸啾憩F(xiàn)為敏感或低度耐藥，MIC測(cè)定結(jié)果在0.125～0.500 μg/mL，因此容易出現(xiàn)結(jié)果不一致的情況。對(duì)于6例測(cè)序無(wú)突變的標(biāo)本中，有4例E探針，1例B探針和1例C探針檢出突變，MIC為0.125 μg/mL，為敏感，可能是探針循環(huán)閾值延遲導(dǎo)致的假陽(yáng)性，或者由于Xpert用的是原始標(biāo)本而基因測(cè)序用的是培養(yǎng)陽(yáng)性的菌株，兩類樣本中的優(yōu)勢(shì)菌群不同導(dǎo)致結(jié)果不一致。MARLOWE等[9]報(bào)道有3株測(cè)序無(wú)突變而Xpert檢出耐藥，均顯示為B探針循環(huán)閾值延遲。而RUFAI等[10]研究則為E探針循環(huán)閾值延遲。在2例表型耐藥而Xpert利福平耐藥未檢出的標(biāo)本中，1例在81 bp的RRDR之外檢測(cè)到E546G突變，1例未檢測(cè)到突變，可能是RRDR之外其他區(qū)域的突變或?yàn)楫愘|(zhì)性耐藥[11-13]。

在測(cè)序結(jié)果中，筆者發(fā)現(xiàn)1例沉默突變菌株(測(cè)序結(jié)果CCG520CCA,氨基酸改變P520P)。該菌株Xpert檢測(cè)為耐藥，比例法檢測(cè)為利福平敏感，MIC為0.060 μg/mL。國(guó)內(nèi)外許多其他的研究也報(bào)道了在81 bp的RRDR區(qū)沉默突變[14-17]。因此，在少數(shù)病例中，Xpert并不能區(qū)別沉默突變，從而可能導(dǎo)致假陽(yáng)性。

在Xpert試驗(yàn)設(shè)計(jì)的5條覆蓋507-533位點(diǎn)的探針中，E探針對(duì)應(yīng)528-533位點(diǎn)，D探針對(duì)應(yīng)523-527位點(diǎn)，C探針對(duì)應(yīng)518-522位點(diǎn)，B探針對(duì)應(yīng)513-517位點(diǎn)，而A探針對(duì)應(yīng)507-512位點(diǎn)。在309例檢出利福平突變探針中，以E探針(65.70%)、D探針(14.56%)和B探針(10.68%)為主，這與利福平耐藥突變位點(diǎn)以531、526、516位點(diǎn)為主一致[18-19]。本研究結(jié)果與其他報(bào)道的探針比例相符[14,20-21]。需要注意的是，單獨(dú)A探針共檢出11例突變，雖然在全部檢出突變的探針中比例不高(3.56%)，但其中8例A探針?biāo)鶛z測(cè)的511位點(diǎn)突變表型藥敏為敏感，提示A探針檢出突變易出現(xiàn)與表型藥敏結(jié)果不一致，這與GURBANOVA等[22]報(bào)道相一致。

利福平耐藥可作為耐多藥結(jié)核的標(biāo)志物，有報(bào)道超過(guò)90%的耐利福平的菌株對(duì)異煙肼耐藥[1,4,23]。本研究結(jié)果顯示，在309例Xpert檢出利福平耐藥的菌株中，MDR-TB占77.35%，雖在復(fù)治患者中MDR-TB的比例(78.80%)稍高于初治患者(75.20%)，但初、復(fù)治患者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這說(shuō)明對(duì)于Xpert檢出利福平耐藥時(shí)，不管患者是否為初治還是復(fù)治，應(yīng)高度懷疑耐多藥的可能。OCHERETINA等[15]報(bào)道153例Xpert檢出利福平耐藥的菌株中，MDR-TB占86.9%，高于本研究結(jié)果，可能與菌株來(lái)源不同及地區(qū)差異有關(guān)。

4 結(jié) 論

Xpert試驗(yàn)適用于利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌的早期快速檢測(cè)，具有較高的敏感度和特異度，可用于MDR-TB的快速篩查，但必要時(shí)還需要結(jié)合患者用藥史和表型藥敏情況來(lái)綜合判斷。