白細胞介素16對動脈粥樣硬化的影響及其機制研究

戈 旺，王 博，閆風連，徐國梅，靳 峰，張青青，馬 群，司傳平△

(1.青島大學基礎醫學院免疫學系，山東青島 266071；2.濟寧市婦幼保健計劃生育服務中心，山東濟寧 272000；3.濟寧醫學院免疫學與分子醫學研究所，山東濟寧 272067；4.濟寧醫學院附屬醫院心內科，山東濟寧 272029；5.濟寧醫學院附屬醫院神經外科，山東濟寧272029)

動脈粥樣硬化(AS)是由血管壁中脂質滯留及其觸發的免疫反應引起的一種慢性炎癥性疾病。巨噬細胞、T淋巴細胞等炎癥細胞，以及多種細胞因子參與AS斑塊形成及其穩定性下降[1-3]。白細胞介素16(IL-16)可由T細胞、巨噬細胞和內皮細胞等分泌產生[4-5]。已有研究表明，IL-16能夠促進 CD4+T細胞、單核細胞及嗜酸性粒細胞的遷移，尤其對CD4+T淋巴細胞具有強烈的趨化作用[6]。但是，也有研究發現IL-16具有抗炎作用，可增加人外周血單個核細胞中FoxP3的表達，并降低T細胞對活化信號的反應，從而發揮潛在的免疫負向調節作用[7]。IL-16在AS相關疾病中的作用尚存在分歧。一方面，有研究提示IL-16可加劇AS進程使斑塊趨向不穩定，從而引發卒中和心肌梗死等[8]；另一方面，IL-16在斑塊中的水平與卒中、心肌梗死等疾病呈負相關，提示IL-16可能具有維持斑塊穩定性的作用[9]。目前，尚缺乏IL-16對于AS影響的直接證據，且IL-16影響AS的具體機制也不明確。本研究擬通過分析AS外周血IL-16水平和AS小鼠模型IL-16水平干預，初步探討IL-16在AS患者和小鼠外周血和AS斑塊中的表達水平，以及IL-16在AS發生、發展中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年8月至2016年8月在濟寧醫學院附屬醫院就診并行冠狀動脈造影檢查確定為AS的患者30例作為病例組，其中男13例，女17例，年齡42～83歲，平均64歲。全部病例均為新發病例。選取同期體檢健康者29例作為健康對照組，其中男12例，女17例，年齡36～75歲，平均62歲。每位受試者空腹抽取靜脈血3 mL入凝血管，另抽取2 mL入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血管備用。凝血管2 000 r/min，離心10 min分離得到血清，-80 ℃保存備用。本研究經過濟寧醫學院附屬醫院倫理委員會批準，所有調查者簽署知情同意書。濟寧醫學院附屬醫院病理科獲取具有代表性2例AS患者頸總動脈斑塊剝脫術后斑塊標本備用。實驗動物采用無特定病原體(SPF)級ApoE-/-小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，養于12 h光照周期、恒溫恒濕SPF環境。相關飼養及處置遵循實驗動物福利原則及濟寧醫學院實驗動物倫理委員會的要求。

1.2儀器與試劑 Cytation5細胞成像酶標儀購自美國BioTek公司，Heraeus Multifuge X1R高速冷凍離心機及TRIzol和逆轉錄試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司。FTC-200 PCR儀購自英國Fedbio公司。顯微鏡型號為日本OLYMPUS IX-ILL30。IL-16酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司，SYBR Green Master Mix購自Vazyme公司。兔抗人IL-16一抗、羊抗兔二抗及CD3抗體均購自英國Abcam公司。

1.3方法

1.3.1ELISA檢測血清IL-16表達水平 采用ELISA檢測血清IL-16表達水平，參照ELISA檢測試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)說明進行操作，繪制標準曲線，計算出IL-16血清水平。

1.3.2外周血單個核細胞IL-16的mRNA水平測定 密度梯度法分離外周血單個核細胞。Trizol法提取標本中單個核細胞總RNA，逆轉錄成cDNA后進行實時定量PCR檢測(RT-qPCR)。總體系10 μL：SYBR Green Master Mix 5 μL，Primer-Reverse 0.5 μL，Primer-Forward 0.5 μL，DDW 3 μL，cDNA 1 μL。PCR反應程序為95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s共40個循環。每個樣品均設置復孔并至少檢測3次。結果分析采用2-ΔΔCt法，其中ΔΔCt=(樣本的Ct值-內參的Ct值)-(對照組Ct值-內參的Ct值)。

1.3.3重組小鼠IL-16的表達與鑒定 構建IL-16和谷胱甘肽融合蛋白原核高表達載體pGEX-IL16-GST，轉化感受態細胞后鑒定并挑選成功轉化菌落于30 ℃，空氣浴搖床80 r/min培養過夜。待細菌濃度吸光度值達到0.5時，加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG，37 ℃ 150 r/min繼續培養1.5 h。離心收獲細菌，提取細胞總蛋白，經GST吸附柱富集IL-16+GST融合蛋白，進一步經Western blot鑒定。

1.3.4免疫組化檢測斑塊中IL-16的表達 從濟寧醫學院附屬醫院病理科收集患者頸總動脈內膜剝脫術后AS斑塊石蠟切片；頸椎脫臼處死AS模型小鼠后，沿腹中線剪開皮膚和胸骨后取腹主動脈根部，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗去血凝塊后迅速放于4%多聚甲醛中固定48 h，然后常規石蠟包埋切片。分別對切片進行HE染色和免疫組化染色，然后在顯微鏡(OLYMPUS IX-ILL30)下觀察拍照。

1.3.5IL-16對AS小鼠斑塊形成的影響 采用ApoE-/-雄性小鼠20只,雌雄各半，將其隨機分為兩組，每組10只。兩組均給予0.25%膽固醇和15%可可油喂食8周。實驗組高脂喂養小鼠于第4周每周1次腹腔注射重組IL-16(每只2 μg)，連續注射4周；對照組小鼠同時給予腹腔注射同等劑量PBS。兩組均在4周后處死小鼠，取小鼠主動脈根部制備連續石蠟切片。

2 結 果

2.1病例組與健康對照組外周血IL-16水平比較 應用ELISA檢測研究對象外周血IL-16水平，病例組IL-16水平明顯高于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1A。病例組患者外周血單個核細胞中IL-16 mRNA水平明顯高于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1B。

注：A為ELISA檢測外周血IL-16水平；B為RT-qPCR檢測外周血單個核細胞中IL-16的mRNA水平;與健康對照組比較，*P<0.05

圖1病例組和對照組外周血IL-16水平及單個核細胞中IL-16的mRNA水平比較

2.2IL-16在人和ApoE-/-小鼠AS斑塊中高表達 通過免疫組化檢測AS患者頸總動脈剝脫術后斑塊中IL-16水平，發現AS患者AS斑塊局部IL-16表達水平高于其周圍非斑塊區，見圖2A。免疫組化染色顯示非高脂喂養ApoE-/-小鼠IL-16表達明顯比高脂喂養AS ApoE-/-小鼠IL-16表達水平低，見圖2B、2C。

注：A為AS斑塊局部IL-16表達水平；B為非高脂喂養ApoE-/-小鼠IL-16表達水平；C為高脂喂養ApoE-/-小鼠IL-16表達水平

圖2人頸總動脈剝脫術斑塊應小鼠斑塊IL-16免疫組化染色(200×)

2.3腹腔注射IL-16可減小高脂喂養AS ApoE-/-小鼠斑塊面積，提高斑塊穩定性 HE染色顯示，與對照組高脂喂養AS ApoE-/-小鼠腹腔注射PBS的相比，注射重組IL-16可減小小鼠AS斑塊的總面積，而且注射PBS對照組小鼠斑塊中CD3+細胞數量明顯多于注射IL-16小鼠主動脈斑塊中CD3+細胞數量，見圖3。此外，與腹腔注射PBS的小鼠對照組AS斑塊相比，腹腔注射IL-16的小鼠斑塊相對穩定，并未破裂，見圖3C、3D。

注：A為腹腔注射PBS的高脂喂養ApoE-/-小鼠斑塊HE染色(200×)；B為腹腔注射IL-16的高脂喂養ApoE-/-小鼠斑塊HE染色(200×)；C為腹腔注射PBS的高脂喂養ApoE-/-小鼠斑塊CD3+免疫組化染色(400×)；D為腹腔注射IL-16的高脂喂養ApoE-/-小鼠斑塊CD3+免疫組化染色(400×)

圖3小鼠主動脈根部斑塊HE染色和CD3+免疫組化染色

3 討 論

IL-16在哮喘、過敏及風濕性關節炎等多種自身免疫性疾病中發揮促炎并加劇病情的作用[10-13]，但其在AS疾病中的作用尚存在分歧。一方面，李秀芹等[8]的研究發現冠心病患者IL-16水平較健康人群高，并據此認為體內升高的IL-16可能增加干擾素γ(IFN-γ)、IL-1β、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-15等促炎細胞因子以及CD40L的表達，進而促進AS斑塊的形成，促使斑塊不穩定，導致冠狀動脈血栓形成。另一方面，有研究報道IL-16在斑塊中的水平可能與卒中、心肌梗死等AS相關疾病的發生呈負相關[9]。GR?NBERG等[14]的研究發現頸動脈斑塊中高水平的IL-16與斑塊的穩定性表型相關。這種穩定性表型以增加的彈性蛋白、膠原蛋白和FoxP3為特征，并在平均21個月的隨訪期內較少發生術后心血管事件。這提示IL-16可能具有維持斑塊穩定和減輕疾病的作用?？傊壳暗难芯績H局限于觀察IL-16和臨床癥狀之間的關系，且研究結果存在分歧，缺乏IL-16影響AS斑塊的直接證據。

本文在前人研究的基礎上檢測了臨床患者IL-16的水平，證實AS患者外周血中IL-16蛋白水平及mRNA水平均明顯高于健康人群，差異有統計學意義(P<0.05)，且在患者頸總動脈斑塊局部發現IL-16高表達。提示IL-16與AS存在密切關系。為進一步研究IL-16對AS斑塊的影響，本研究把誘導純化的IL-16腹腔注射到ApoE-/-小鼠模型體內，發現IL-16可以有效地減小斑塊形成、降低斑塊內CD3+細胞的含量、增加斑塊穩定性。這提示IL-16在AS疾病中可能發揮保護性的作用。

IL-16是一種具有多種功能的細胞因子。一般認為IL-16主要發揮促進炎癥的作用，但也有研究發現IL-16具有抵抗炎癥的作用。有研究者發現，IL-16可增加FoxP3的表達，并降低T細胞對刺激的反應，具有潛在的免疫調節作用[9]。MCFADDEN等[7]的研究表明IL-16優先吸引調節性T細胞的遷移，且被IL-16吸引的調節細胞表達更高水平的FoxP3。本研究發現，IL-16干預導致小鼠斑塊局部CD3陽性水平顯著降低，局部炎癥減輕。提示IL-16在小鼠AS模型中可能更多地發揮抗炎作用，并且可能由此導致AS負荷的降低。

本研究結果表明，IL-16可以減小斑塊面積，減輕斑塊局部炎癥水平，發揮抵抗AS斑塊形成、增加斑塊穩定性的作用，提示IL-16在AS中可能發揮保護性的作用。AS患者血清和斑塊中IL-16的水平升高可能是由疾病導致的補償性反應。本研究結果提示，IL-16可能作為一種監測AS發展和預后的指標，也是治療AS的新靶點。但本研究還存在一些不足之處，選取研究對象數量較少，后續研究會選擇更大量的研究樣本，以期為臨床提供更加可靠的參考。

4 結 論

本研究通過檢測AS患者外周血、AS斑塊組織及AS小鼠動脈斑塊，證實IL-16在AS患者外周血和AS小鼠斑塊中均高表達。通過腹腔注射AS小鼠重組IL-16，發現IL-16可能具有穩定AS斑塊的作用。