艾灸對克羅恩病大鼠結腸c-Jun氨基末端激酶信號通路的影響＊

張 霽，吳麗潔，李志元，吳煥淦,，楊延婷,，李茜瑩，吳丹艷，智方圓，洪 玨，劉 婕，張 丹,＊＊，馬曉芃,＊＊

（1.上海中醫藥大學 上海 201203；2.上海市針灸經絡研究所 上海 200030；3.浙江省中醫院 杭州 310006）

克羅恩病（Crohn's Disease，CD）是消化科常見疑難病，以結腸局灶性、非特異性的炎癥損傷和肉芽腫為主要病變特征，在世界范圍內其發病率逐年升高[1，2]。CD患者反復經歷腹痛、腹瀉、便血等癥狀，生活質量降低，其腸外表現多樣，且并發癥多嚴重兇險[3，4]。誘導并維持臨床緩解以及黏膜愈合，防治并發癥，改善患者生命質量是國內較為公認的炎癥性腸病（包括克羅恩病和潰瘍性結腸炎）的治療目標[5]。因此，防治早中期CD、促使臨床緩解、延緩疾病進展具有十分重要的意義。

近年來，研究證實艾灸雙側天樞、氣海穴等對CD患者臨床癥狀、生活質量有良好的改善作用[6；7]。艾灸具有促進結腸血液循環、增強腸道蠕動、修復結腸損傷黏膜、調節結腸免疫反應、提高患者自愈率以及減少病變復發等作用，有療效溫和、治療感受度好等特點，尤其在改善結腸炎患者腹痛、腹瀉等各種癥狀方面有著較好的效果[8；9]。盡管艾灸治療CD的短期療效和長期療效已被普遍認可，但其作用機制依舊不十分明確。深入揭示艾灸治療CD的作用機制有助于促進艾灸在CD治療中的應用與推廣。慢性、非特異性、透壁性炎癥反應是CD的根本病變，CD患者局部結腸存在大量炎性細胞浸潤和各種細胞因子的異常表達[5，10]。有研究證實，絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）參與了CD結腸的炎癥反應和組織損傷，該通路的靶向抑制有助于結腸炎的緩解[11，12]。艾灸對CD有較好的抗炎及促進黏膜愈合的作用[13-15]，是否與MAPK信號通路調節有關？目前尚未見相關研究。因此，本課題采用三硝基苯磺酸（2，4，6 Trinitrobenzene-sulfonic acid，TNBS）合乙醇溶液灌腸建立CD大鼠模型，觀察艾灸對CD大鼠結腸單核細胞趨化因子1（Monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1）、環氧合酶2（Cyclooxygenase 2，COX2）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、核轉錄因子c-Jun的影響，從JNK信號通路調節角度，探討艾灸治療CD及其抗炎效應的可能免疫學機制，為艾灸治療CD療效機制的闡明提供科學實驗資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性清潔級SD（S prague-Dawley）大鼠36只，體質量（150±20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號：SCXK（滬）2013-0016，飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心。飼養條件：清潔級，8∶00-20∶00光照、20∶00-8∶00黑暗，溫度（20±1）℃，濕度50%左右，自由飲水、攝食。適應性飼養1周，大鼠飲食、活動正常后開始實驗。SD大鼠隨機分為正常組、模型組、艾灸組和假灸組，每組9只。本實驗經上海中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器

5%TNBS（Sigma公司）；Trizol（Invitrogen公司）；DEPC水（基爾頓生物公司）；SYBR Green PCR試劑盒（Thermo公司）；逆轉錄試劑盒（Fermentas公司）；MCP-1、COX2、JNK、c-Jun ELISA檢測試劑盒（武漢基因美生物公司）；蘇木素染色液（南京建成生物公司）；伊紅染色液（南京建成生物公司）；戊巴比妥鈉（國藥集團有限公司）；異丙醇、無水乙醇、氯仿、二甲苯、中性樹膠（國藥集團有限公司）。

熒光顯微鏡及senscell分析軟件（Olympus公司）；PCR檢測儀（ABI公司）；酶標儀（Labsystems Multiskan公司）；洗板機（Thermo Labsystems公司）；組織脫水機、包埋機、切片機、攤片機（Leica公司）。

1.3 CD模型制備

采用TNBS合乙醇溶液灌腸制備CD模型[16]。開始前大鼠禁食、不禁水24 h，將無水乙醇加雙蒸水配成50%乙醇，然后將TNBS與50%乙醇按照體積比2∶1混合成TNBS灌腸液；稱重后以生理鹽水配置的2%戊巴比妥鈉（30 mL?kg-1）行腹腔注射麻醉，造模大鼠以TNBS灌腸液3 mL?kg-1灌腸。具體操作：大鼠體位為頭下尾上，將灌腸針緩緩插入大鼠肛門6-8 cm，注入灌腸液，拔出灌腸針以后再將大鼠倒立1-2 min，以防灌腸液溢出。每7 d重復灌腸1次，共4次。造模結束后，每組隨機抽取1只大鼠，進行結腸蘇木素-伊紅染色（Hematoxylin-eosin staining，HE），以確定模型制備是否成功。在確定模型制備成功的基礎上，開始干預治療。

1.4 分組與處理

艾灸組，采用隔藥灸治療，選取天樞（雙側）、氣海穴，每次每穴各灸2壯（約10 min），每日1次，共7次。藥餅主藥為附子粉，灸前用黃酒調和，并用動物專用模具制成藥餅。用模具將艾絨壓實制成錐形艾炷，艾炷重量為90 mg，置于藥餅上，點燃艾炷施灸。假灸組取穴、藥餅、艾炷操作均同艾灸組，但不點燃艾炷，每次留置10 min，每日1次，共7次。模型組與正常組不進行任何治療，只作與艾灸組相同的抓取與固定。

1.5 樣本處理

各組大鼠禁食、不禁水24 h，腹腔注射戊巴比妥鈉進行麻醉。沿大鼠腹正中線剪開腹部皮膚，充分暴露直腸、結腸部分，自恥骨聯合處-盲腸取下結腸，沿腸系膜縱軸剖開，取自上而下的3 cm結腸組織，用4℃冷生理鹽水沖洗，分成3段，1段放入4%多聚甲醛溶液內固定；2段放入凍存管置于液氮內，后移入-80℃冰箱保存。

1.6 指標檢測方法

1.6.1 結腸組織形態學觀察

采用HE染色，光學顯微鏡下觀察各組大鼠結腸組織形態學變化。主要步驟：結腸組織脫水、包埋、切片、烤片處理，二甲苯、梯度酒精中脫蠟脫水，蘇木素染色，1%鹽酸酒精分化，溫水返藍，0.5%伊紅染色，再依次經梯度酒精至水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察并進行結腸組織學評分。

表1 JNK、c-Jun mRNA實時熒光定量PCR引物設計

1.6.2 結腸MCP-1、COX2、JNK、c-Jun蛋白濃度的檢測

采用酶聯免疫吸附測定法（Enzyme Linked Immunoserbent Assay，ELISA）測定。按照ELISA檢測試劑盒說明書，按適當比例稀釋待測樣本，于96孔板中依次加入待測樣本、親和素、酶標試劑，充分混勻，37℃孵育。去除以上液體，再依次加入顯色劑A、顯色劑B，充分混合，37℃避光顯色。最后，加入終止液終止顯色反應。酶標儀450 nm波長下測定OD值，蛋白含量與OD值之間呈正線性關系，通過繪制標準曲線計算出標本中目的蛋白的濃度。

1.6.3 結腸JNK、c-Jun的mRNA表達檢測

采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測，主要步驟包括：①組織總RNA的抽提；②總RNA中DNA的消除：DNaseⅠ 1 μL；10×DNaseⅠBuffer 1 μL；總RNA≦1 ng；DEPC-H2O nμL。③逆轉錄cDNA：RNA-Primer Mix 12 μL；5×RT Reaction Buffer 5 μL；25 mM dNTPs 1 μL；25 U/μL RNase Inhibitor 1 μL；200 U/μL M-MLV Rtase 1 μL；Oligo(dt)181 μL；ddH2O(DNase-free)4 μL。PCR 擴增：SYBR Green Mix 12.5 μL；Primer F 0.5 μL；Primer R 0.5 μL；ddH2O 9.5 μL；cDNA模板2 μL。④Real-time PCR擴增。擴增條件：95℃，10 min(95℃，15 Sec；60℃，45 Sec)×40；95℃，15 Sec；60℃，1 min；95℃，15 Sec；60℃，15 Sec。記錄Ct值，以GAPDH作為內參，通過2-△Ct法計算目的蛋白mRNA的相對表達水平。

1.7 統計學方法

實驗數據采用SPSS 20.0進行統計分析，對各組數據進行正態分布和方差齊性檢驗，符合正態分布或近似正態分布的資料采用xˉ±s的形式表示；不符合正態分布的資料采用Median(Q25，Q75)的形式表示。若各組方差齊等，直接采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進行檢驗，如果檢驗結果有統計學意義則進一步采用LSD檢驗做兩兩比較。若各組方差不齊，采用非參數檢驗。結果以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠結腸組織病理學觀察

光鏡下觀察，正常組大鼠結腸組織結構完整，黏膜上皮連續覆蓋，黏膜固有層單層杯狀細胞、腺腔排列整齊，黏膜下層為疏松結締組織，未見水腫或增生。模型組大鼠結腸損傷嚴重，主要表現為結腸局部黏膜上皮層缺失，裂隙性潰瘍形成，黏膜下結締組織明顯水腫伴大量淋巴細胞浸潤，黏膜下層可見成團單核巨噬細胞聚集，局部杯狀細胞增生明顯，腺腔排列不規則；與正常組比較，模型組大鼠結腸組織病理學評分顯著增加（P＜0.01）。艾灸組大鼠結腸組織損傷明顯改善，表現為黏膜上皮層完整，大量杯狀細胞增生，單層杯狀細胞、腺腔排列尚整齊，黏膜下層結締組織輕度水腫，可見少量膠原纖維及淋巴細胞浸潤；與模型組、假灸組比較，艾灸組結腸組織病理學評分均降低（均P＜0.01，P＜0.05）。與模型組比較，假灸組大鼠結腸損傷無明顯減輕，評分差異無統計學意義（P＞0.05）（圖1，表2）。

2.2 結腸MCP-1、COX2蛋白濃度的檢測結果

與正常組比較，模型組大鼠結腸MCP-1、COX2蛋白濃度明顯增高（均P＜0.01）。與模型組比較，艾灸組大鼠結腸MCP-1、COX2蛋白濃度明顯降低（P＜0.01，P ＜ 0.05）；假灸組大鼠結腸MCP-1、COX2蛋白濃度無明顯變化（均P＞0.05）。與假灸組比較，艾灸組大鼠結腸MCP-1、COX2蛋白濃度顯著降低（P＜0.01，P ＜ 0.05）（表3）。

2.3 結腸JNK蛋白濃度及mRNA表達的檢測結果

與正常組比較，模型組大鼠結腸JNK蛋白濃度及mRNA表達均明顯增加（均P＜0.01）。與模型組比較，艾灸組大鼠結腸JNK蛋白濃度及mRNA表達均減低（均P＜0.01）；假灸組大鼠JNK蛋白濃度及mRNA表達無明顯變化（均P＞0.05）。與假灸組比較，艾灸組大鼠結腸JNK蛋白濃度及mRNA表達均顯著減少，差異有統計學意義（均P＜0.01）（表4）。

2.4 結腸c-Jun蛋白濃度及mRNA表達的檢測結果

與正常組比較，模型組大鼠結腸c-Jun蛋白濃度及mRNA表達均無顯著變化（均P＞0.05）。與模型組比較，艾灸組、假灸組大鼠結腸c-Jun蛋白濃度及mRNA表達均無顯著變化（均P＞0.05）（表5）。

3 討論

盡管口服藥物或生物制劑的研發和應用日趨成熟，但諸多報道顯示CD的靶向治療存在療效個體差異性和副反應不明確等問題，已有研究提出兩個以上藥物聯合的多靶點治療或有助于提高臨床療效，但結果尚待考證[17]。傳統針灸療法對機體的調節作用是多系統、多靶點的，能較好地發揮多向性治療效應，在緩解CD患者臨床癥狀和促進黏膜愈合同時，避免了一些不良反應，是一種值得關注和推薦于臨床治療CD的有效手段。本研究結果發現，艾灸對CD大鼠結腸組織損傷和炎癥反應有一定緩解作用，或與其對JNK信號通路調節有關，為艾灸治療IBD機制的闡明提供了科學實驗資料和研究思路。

MAPK信號通路激活被證實與IBD結腸炎性損傷關系密切[11]。MAPK家族的信號通路一般主要包括胞外信號調節蛋白激酶（Extracellular signal regulated kinase，ERK）、c-Jun氨基末端激酶/應激激活蛋白激酶（JNK/SAPK）、p38MAPK、ERK5。JNK下游常見的轉錄因子有Jun家族（c-Jun、JunB、JunD）、ATF-2、c-Myc、NFAT家族、STAT家族，大部分轉錄因子磷酸化主要增加了轉錄活性，誘導基因表達[18]。已有研究發現，靶向抑制p38信號通路可以調節CD大鼠結腸上皮細胞凋亡，促進結腸損傷修復，但臨床研究并未有充分證據證實口服p38蛋白酶抑制劑在CD治療中的療效，其他家族激酶ERK、JNK、ERK5少有研究報道[19，20]。盡管存在爭議，但有12例的小樣本臨床觀察提示聯合抑制JNK和p38對CD病人疾病指數（CD Activity Index，CDAI）、結腸損傷有明顯緩解作用，提示靶向調節JNK可能是治療CD的有效機制[21]。本課題從JNK信號通路調控角度，研究艾灸治療CD、發揮抗炎效應的作用機制，結果顯示艾灸下調了結腸JNK蛋白和mRNA的表達，降低結腸炎性蛋白MCP-1、COX2的含量，提示艾灸可能通過抑制結腸JNK信號通路進而減少結腸MCP-1、COX2等炎性蛋白的含量發揮緩解腸道炎癥、促進結腸損傷修復的作用，這與部分從ERK、NF-κB途徑研究的報道有所不同[15；22]。另外，我們的研究發現艾灸對結腸c-Jun蛋白和mRNA表達沒有調節作用，是否與本研究未檢測該蛋白的磷酸化活性、抑或是通過JNK通路其他下游轉錄因子的激活發揮作用，需待進一步的研究以進一步證實。

圖1 各組大鼠結腸組織HE染色結果（×200倍）

表2 各組大鼠結腸組織病理學評分的比較

表3 各組大鼠結腸MCP-1、COX2蛋白濃度的比較

表4 各組大鼠結腸JNK蛋白濃度及mRNA表達的比較

表5 各組大鼠結腸c-Jun蛋白濃度及mRNA表達的比較

研究發現，JNK的上游激活機制受到諸多因素影響，胞外白介素17（Interleukin 17，IL-17）、IL-1β、腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor α，TNF-α）均可激活胞內JNK上游激酶，使信號傳導至JNK，JNK再通過磷酸化一系列底物進一步將信號傳遞至下游核轉錄因子，促進IL-1β、TNF-α、誘導型一氧化氮合成酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOs）、前列腺素 E2（Prostaglandin E2，PGE2）等炎性因子表達[23]。盡管課題組前期研究工作提示，隔藥灸對CD大鼠結腸IL-17、IL-1β、TNF-α（JNK上游激活信號）有良好調節作用，參與了緩解炎癥、促進結腸損傷愈合，但依舊缺少與之相關的信號通路級聯激活的系統研究[24-26]。因此，本研究深入觀察了這些胞外激活信號下游的JNK信號通路，從調節JNK信號通路角度闡釋艾灸治療CD的抗炎機制。由于艾灸對機體的調節作用是多靶點、多角度的，因此今后尚需進一步從ERK、p38MAPK通路角度開展艾灸治療克羅恩病機制研究，以期系統全面地揭示艾灸對克羅恩病MAPK信號通路的調控機制。