廣藿香超聲輔助提取工藝考察＊

朱浩東，吳卓娜，吳衛剛，王 冰，張 彤＊＊

（1.上海中醫藥大學中藥學院 上海 201203；2.河北楚風中藥飲片有限公司安國 071200；3.上海中醫藥大學教學實驗中心 上海 201203）

廣藿香藥材為唇形科植物廣藿香Pogostemon cablin（Blanco）Benth.的干燥地上部分，具有芳香化濁，和中止嘔，發表解暑之功效[1]。廣藿香的化學成分包括揮發油、黃酮和生物堿等[2]，揮發油為其主要活性成分[3]，具有抗炎、抗真菌[2]、鎮痛[4]、化痰止咳[5]、殺蟲抑菌[6，7]等藥理作用。廣藿香揮發油中廣藿香醇（Patchouli alcohol，PA）含量最高[8]，亦稱百秋李醇，是一種三環倍半萜類小分子揮發性化合物[2]。2015版《中國藥典》將廣藿香醇作為廣藿香藥材及廣藿香油的含量測定指標[1，9]。

目前，廣藿香醇含量測定法主要為氣相色譜法[10-16]。現有的廣藿香油及廣藿香醇的提取方法，主要有浸提法[17]、CO2超臨界萃取法（SFE-CO2）[18，19]、水蒸汽蒸餾法[18，20]及三氯甲烷超聲輔助提取法[1，21]等 。 其中，浸提法耗時過長，SFE-CO2法所需設備昂貴，水蒸汽蒸餾法耗能較大，而超聲輔助提取法具有提取時間短、提取效率高的特點，可防止一些不穩定物質在高溫和長時間提取條件下發生降解、褪色等變化[22，23]，適合于以廣藿香揮發油或廣藿香醇的提取工藝。但現有的三氯甲烷超聲輔助提取法，所用提取溶劑安全性不佳，考察以安全性更好的乙醇為溶劑進行廣藿香超聲輔助提取非常有必要。因此，本文以提取時間（min），乙醇濃度（%）和液料比（mL·g-1）為影響因素，以提取物中廣藿香醇的含量為考察指標，利用單因素試驗優化廣藿香超聲輔助提取工藝，并用GC-FID法測定廣藿香醇含量。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

氣相色譜儀（7890B，美國Agilent公司）；氫火焰離子化檢測器（Agilent公司）；超聲波清洗機（SB5200D，寧波新芝生物科技股份有限公司）；粉碎機（上海廣沙工貿有限公司）；電子分析天平（XS105DU，瑞士梅特勒-托利多公司）；電子天平（BS124S，北京賽多利斯科學儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（DK-S24，上海精宏實驗設備有限公司）；循環水式多用真空泵（SHBIIIS，鄭州長城科工貿有限公司）。

1.2 試劑

圖1 空白溶劑、內標溶液、對照品溶液及供試品溶液GC-FID色譜圖

廣藿香醇對照品（99%，110772-201608，中國食品藥品檢定研究院）；正十八烷（20160706，國藥集團化學試劑有限公司）；水為純化水；乙醇除特殊標記，均為95%乙醇，其余試劑均為分析純。廣藿香飲片（莖和葉）采購自廣東道地良藥館（0016M60913），經上海中醫藥大學張紅梅博士鑒定為廣藿香Pogostemon cablin（Blanco）Benth.，現保存于上海中醫藥大學教學實驗中心。

2 方法與結果

2.1 色譜條件[1]

彈性石英毛細管柱（Agilent HP-5：30 m×0.32 mm，0.25 μm）；程序升溫：初始溫度150℃，保持23 min，以3℃·min-1的速率升至230℃，保持2 min；進樣口溫度：280℃；檢測器溫度：280℃；分流比：20:1；進樣量：1 μL。

2.2 對照品貯備液的制備

精密稱取廣藿香醇對照品35.57 mg，置于10 mL容量瓶中，加95%乙醇溶解定容，搖勻，制成濃度為3.557 mg·mL-1的對照品貯備液[24，25]，置 4℃冰箱冷藏備用。

2.3 內標溶液的制備

精密稱取正十八烷507.00 mg，置于100 mL容量瓶中，加正己烷溶解定容，搖勻，制成濃度為5.070 mg·mL-1的內標溶液，置4℃冰箱冷藏備用。

2.4 供試品溶液的制備

精密稱取廣藿香粗粉3.00 g置具塞錐形瓶，加入60 mL95%乙醇，超聲提取30 min，濾過，收集濾液，回收溶劑至干，以少量多次原則滴加乙醇溶解提取物[25]，轉至10 mL容量瓶，精密加入1 mL內標溶液，乙醇定容至刻度，搖勻，微孔濾膜（0.45 μm）過濾，續濾液即為供試品溶液。

2.5 專屬性考察

精密稱取一定量廣藿香粗粉，按“2.4供試品溶液的制備”方法，制得樣品溶液。分別取空白乙醇溶液、內標溶液、對照品溶液及供試品溶液，按“2.1”項下條件，進樣GC系統測定。比較空白乙醇溶液及內標溶液對廣藿香醇的測定有無干擾。結果表明，在該方法下空白溶劑和內標物正十八烷對廣藿香醇的測定無干擾（圖1）。

2.6 線性關系考察

分別精密吸取廣藿香醇對照品貯備液2000、1000、800、600、400、200、100 μL于5 mL量瓶，精密加入0.5 mL內標溶液，乙醇定容至刻度，搖勻，制成濃度分別為1.4228、0.7114、0.5691、0.4268、0.2846、0.1423和0.0711 mg·mL-1的系列廣藿香醇對照品溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，取1μL續濾液注入氣相色譜儀，記錄峰面積，以質量濃度（mg·mL-1）為橫坐標，廣藿香醇對照品峰面積與內標物峰面積比為縱坐標，繪制標準曲線并計算回歸方程。得線性回歸方程為y=1.8104x+0.0031，r=0.9999，結果表明，廣藿香醇在0.0711-1.4228 mg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.7 精密度考察

2.7.1 日內精密度

精密吸取 0.1423、0.4268、0.7114 mg·mL-1的低、中、高三個濃度的廣藿香醇對照品溶液，按“2.1”項下條件，分別連續重復進樣6次，記錄峰面積并計算RSD值。RSD值分別為0.17%、0.73%、0.22%。

表1 加樣回收率結果

2.7.2 日間精密度

精密吸取 0.1423、0.4268、0.7114 mg·mL-1的低、中、高三個濃度的廣藿香醇對照品溶液，按“2.1”項下條件，連續3天，每天重復進樣3次，記錄峰面積并計算RSD值。RSD值分別為0.73%、1.02%、1.17%。

2.8 重復性考察

按“2.4供試品溶液的制備”方法，平行制備6份樣品溶液，進樣GC系統測定廣藿香醇含量，并計算RSD值。RSD為0.88%，表明該方法重復性好。

2.9 穩定性考察

精密吸取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12和24 h進樣GC系統測定，記錄峰面積并計算RSD值。RSD值為0.56%，表明樣品在測定的24 h內穩定。

2.10 加樣回收率考察

精密稱取已知含量的廣藿香粗粉9份，每份1.50 g，分為低、中、高濃度3組，每組3份，分別加入相當于樣品含量50%、100%和150%的廣藿香醇對照品溶液，按“2.4供試品溶液的制備”方法制得樣品溶液，按“2.1”項下GC條件測定廣藿香醇的含量，并計算低、中、高三個濃度的加樣回收率。

在50%、100%和150%的對照品加入量下，廣藿香醇測定方法的平均回收率分別為98.88%、98.36%和102.18%，且RSD值均＜3.00%，說明該方法回收率較好（表1）。

3 提取工藝考察

3.1 提取時間考察

精密稱取廣藿香粗粉3.00 g置具塞錐形瓶，平行3份，加入48 mL乙醇溶液，分別超聲提取20、30、40、50、60 min，濾過，收集濾液，回收溶劑，以少量多次原則滴加乙醇溶解提取物，轉至10 mL容量瓶，精密加入1 mL內標溶液，乙醇定容至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，取續濾液，按“2.1”項下條件，進樣GC系統測定廣藿香醇含量。由圖2可知，隨著提取時間延長，當提取時間在20-30 min時，廣藿香醇含量不斷增加；但當提取時間超過30 min以上時，廣藿香醇含量并未隨提取時間延長而增加。因此，選擇超聲提取30 min較為適宜。

3.2 乙醇濃度考察

精密稱取廣藿香粗粉3.00 g置具塞錐形瓶，平行三份，分別加入80%、85%、90%、95%、100%濃度的乙醇溶液48 mL，超聲提取30 min，濾過，收集濾液，回收溶劑，以少量多次原則滴加乙醇溶解提取物，轉至10 mL容量瓶，精密加入1 mL內標溶液，乙醇定容至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，取續濾液，按“2.1”項下條件，進樣GC系統測定廣藿香醇含量。當乙醇濃度在80%-90%范圍內時，提取物中廣藿香醇含量的升高趨勢較小；當乙醇濃度由90%-95%時，提取物中廣藿香醇含量增加較大；當乙醇濃度為100%時，廣藿香醇含量并無明顯提高（圖3）。因此，選擇95%濃度乙醇作為提取溶液較適宜。

3.3 液料比考察

精密稱取廣藿香粗粉3.00 g置具塞錐形瓶，平行3份，分別加入24、36、48、60、72 mL乙醇溶液，超聲提取30 min，濾過，收集濾液，回收溶劑，以少量多次原則滴加乙醇溶解提取物，轉至10 mL容量瓶，精密加入1 mL內標溶液，乙醇定容至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，取續濾液，按“2.1”項下條件，進樣GC系統測定廣藿香醇含量。當料液比在8∶1-20∶1 mL·g-1時，廣藿香醇含量呈上升趨勢，并且在20∶1 mL·g-1時含量最高；當液料比增大至24∶1時廣藿香醇含量并無提高（圖4）。因此，確定液料比為20∶1 mL·g-1較為適宜。

圖2 提取時間對廣藿香醇含量的影響（n=3）

圖3 乙醇濃度對廣藿香醇含量的影響（n=3）

圖4 液料比對廣藿香醇含量的影響（n=3）

4 討論與總結

廣藿香醇為廣藿香的主要活性成分，為一種揮發性的小分子化合物，不溶于水，而溶于醇、醚等有機溶劑。然而廣藿香醇不易從廣藿香中直接提取，故常以廣藿香提取物或廣藿香油作為藥用成分。目前關于廣藿香提取工藝的報道，較少以乙醇作為提取溶劑，且多以出油率作為考察指標。受生長條件、提取工藝等因素影響，出油率并不一定能反映廣藿香醇含量。因此，以廣藿香醇含量為指標進行工藝優化有一定的必要性。

因文獻報道廣藿香乙醇提取物不能完全溶于正己烷[25]，經實驗發現以正己烷溶解本實驗乙醇提取物時亦有溶解不完全現象，而研究報道廣藿香醇在95%乙醇中溶解性好[24]，因此，為保證提取物中廣藿香醇能夠提取完全，在供試品溶液制備時，本文選擇更為安全綠色的95%乙醇作為供試品溶液制備的提取溶劑，而未選用藥典中測定藥材所使用的正己烷作為供試品處理溶劑。

本文以廣藿香醇含量為指標，從對于提取效果影響較大的提取時間、乙醇濃度、料液比三個主要因素進行單因素考察，確定適宜廣藿香藥材最佳超聲輔助提取條件為：超聲時間30 min，乙醇濃度為95%，液料比20∶1 mL·g-1。在該工藝條件下，廣藿香醇提取率為32.75%，含量為0.15%（按干燥藥材計）。該法便于產業化操作，安全無污染，為廣藿香醇的工業超聲輔助提取工藝的應用提供了實驗室依據。