隔藥灸對潰瘍性結腸炎大鼠結腸NF-κB和STAT3活性的免疫調節(jié)機制＊

趙繼夢，吳煥淦,，陸 嫄，顧沐恩，馬 喆，劉雅楠，鄭寒丹，劉慧榮,，馬曉芃,＊＊，黃 艷,＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學上海市針灸經絡研究所 200030上海；2.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院 200437 上海）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性和復發(fā)性的炎癥性腸病，發(fā)病率逐年升高[1，2]，UC的持續(xù)治療至關重要，未經治療的UC患者復發(fā)率高，長期反復發(fā)作的結腸炎癥還有可能引起結腸炎相關性癌變[3，4]。盡管UC的發(fā)病機制尚未明確，但研究表明UC累及結腸上皮組織，激活黏膜及黏膜下層組織免疫細胞，產生過多的炎癥相關的細胞因子[5]。UC免疫的失調與COX-2、iNOS、NF-κB、STAT家族和AP-1等炎癥相關蛋白的上調密切相關[6，7]。核轉錄因子NF-κB在UC免疫調節(jié)中發(fā)揮關鍵作用[8]。在正常情況下，NF-κB作為一種核轉錄因子，在真核生物結腸上皮細胞中正常是RelA(p65)/p50二聚體形式，靜息狀態(tài)下NF-κB抑制因子α（IκB-α）和NF-κB形成復合體，存在細胞質[9]。炎癥刺激致IκB蛋白被磷酸化、泛素化而水解，NF-κB轉入細胞核中與DNA特異性位點結合，調節(jié)靶基因的轉錄，如促炎癥反應的酶和細胞因子COX2、IL-1β、IL-6及TNF-α[10]。據報道，STAT3與結腸的免疫炎癥密切相關，能激活大量的細胞因子和生長因子[11，12]。活化的轉錄因子STAT3被磷酸化，轉入細胞核中能調節(jié)靶基因的轉錄，參與細胞凋亡、細胞周期進展與增殖和血管生成等生物學過程。NF-κB和STAT3之間還存在多種作用形式，未磷酸化的STAT3可直接取代NF-κB和IκB-α蛋白復合物中IκB-α的位置與RelA形成復合物，共同誘導基因的轉錄，STAT3增強NF-κB的活性并促使其向細胞核內轉移；另外，NF-κB和STAT3也有可能未形成復合物，共同作用于基因的相同的啟動子區(qū)域，共同調節(jié)基因的轉錄[13，14]。研究發(fā)現，在DSS誘導的小鼠結腸炎模型、活動性、非活動性UC患者結腸上皮組織固有層中，STAT3磷酸化水平均增加[15，16]。前期研究結果表明艾灸對UC患者有效[17-19]，其潛在的機制與抑制NF-κBp65有關，繼而抑制炎性細胞因子和炎性介質的合成和分泌，發(fā)揮免疫抗炎效應[20-21]。因此，本研究從雙轉錄因子NF-κB、STAT的角度，探討艾灸對DSS誘導的UC大鼠結腸組織NF-κB信號通路、STAT3磷酸化的免疫調節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組及UC模型制備[22]

健康成年雄性SD清潔型大鼠26只，體質量200±20 g，由上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供[使用許可SYXK（滬）2012-0002]，動物飼養(yǎng)溫度在20±2℃，濕度保持在50%-70%左右，12 h/12 h光照和黑暗交替，自由進食和飲水，適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分成2組，正常大鼠8只和造模大鼠18只，每天稱量大鼠體重。18只造模大鼠連續(xù)自由飲用4%DSS（分子量：3.6-5萬，MP Bio公司）水溶液7天，取2只大鼠進行HE染色，通過組織病理學進行模型鑒定。正常組（NC）8只，將造模成功的16只大鼠隨機分成UC組（UC）8只和隔藥灸組（HM）8只，自由飲用1%DSS水溶液7天維持。

1.2 艾灸干預措施

隔藥灸于造模結束后開始，提前1天剔除腹部鼠毛。將藥粉（附子、肉桂、木香等）按比例用黃酒調制呈厚糊狀，用模具做成直徑1 cm、厚0.5 cm的藥餅。抓取大鼠并固定在自制大鼠固定器上，暴露雙側天樞穴，將配制好的藥餅置于穴位上，上置艾炷施灸，每壯艾炷大小約90 mg，每次每穴灸2壯，每日1次，連續(xù)灸7天。穴位定位參照余曙光主編《實驗針灸學》（人民衛(wèi)生出版社，2016年第二版）。正常組和模型組給予相同的抓取和固定。

1.3 HE染色

切片常規(guī)脫蠟至水：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各20 min，梯度酒精無水-95%-90%-80%-70%乙醇各5 min，雙蒸水5 min×2次；蘇木素浸染5 min，自來水流水沖洗10 min，1%鹽酸酒精分化1-2 s，流水沖洗5 min，伊紅浸染5 min；脫水透明：依次浸入上行梯度酒精：70%-80%-90%-100%乙醇各2 s；二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明各15 min；封片吹干后光學顯微鏡下觀察大鼠結腸黏膜組織病理學變化。

1.4 ELISA檢測

取出-80℃保存的血清，融化后混勻離心，按照IL-1β、IL-6的ELISA試劑盒（上海源葉生物科技有限公司）的步驟操作，標準孔中依次加入標準品，每孔50 μL，除了空白孔外，樣本孔依次加入待測樣本各10 μL，再加入樣本稀釋液各40 μL并混勻。將HRP標記的檢測抗體各100 μL加入標準品孔和樣本孔中，空白孔不添加，置于37℃恒溫箱中溫育60 min；洗板5次，并在濾紙上充分印干。每孔依次加入底物A和B各50 μL，置于37℃恒溫箱中避光孵育15 min；每孔加入終止液50 μL。用全波段酶標儀檢測，根據標準品換算出樣本的濃度。

1.5 Western Blot檢測

取出-80℃保存的結腸組織，勻漿后加RIPA裂解液冰上放置10 min，15000 rpm 10 min離心取上清；采用BCA蛋白定量法測定濃度，調整各樣本濃度一致變性后，經電泳-轉膜-封閉后，分別加入一抗p-STAT3Tyr705（1:2000，CST美國）、STAT3、IκB-α、NF-κBp65、α-tubulin和GAPDH（1:1000，CST 美國）、pIκB-α（1:1000，Santa Cruz Biotechnology，美國）4℃孵育過夜，TBST洗膜后，分別加入對應的二抗（兔抗或鼠抗）室溫孵育1 h，凝膠成像系統拍攝條帶圖，使用Image Pro Plus軟件分析灰度值。

1.6 統計學分析

采用SPSS 22.0統計軟件，所有計量資料均用均數±標準差（xˉ±s）表示，符合正態(tài)分布的數據采用單因素方差分析比較組間差異，不符合正態(tài)分布的數據采用非參數檢驗，檢驗水準α=0.05，P＜0.05差異有統計學意義。

圖1 各組大鼠結腸組織病理學變化

圖2 各組大鼠血清IL-1β和IL-6的蛋白濃度的比較

2 結果

2.1 隔藥灸對DSS誘導的UC大鼠的組織病理學觀察

正常組的結腸黏膜上皮完整，無潰瘍發(fā)生，各層組織結構清晰，腺體排列整齊，黏膜層僅見少量炎癥細胞浸潤，間質無充血水腫；UC組的大鼠結腸黏膜上皮不完整，有潰瘍面，黏膜層腺體減少，杯狀細胞明顯減少，間質中及黏膜下層見大量淋巴細胞、漿細胞、中性粒細胞浸潤；與UC組比較，隔藥灸組的大鼠結腸黏膜可見愈合性潰瘍，黏膜層腺體增加，杯狀細胞明顯增多，黏膜及黏膜下層可見少量淋巴細胞、中性粒細胞浸潤（圖1）。

2.2 隔藥灸對DSS誘導的UC大鼠血清IL-1β、IL-6蛋白濃度的影響

與正常組比較，UC組的大鼠血清IL-1β、IL-6蛋白濃度均顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；與UC組比較，隔藥灸組大鼠血清IL-1β、IL-6蛋白濃度均顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖2）。

2.3 隔藥灸對DSS誘導的UC結腸組織STAT3磷酸化和NF-κB通路蛋白表達的影響

與正常組比較，UC組結腸組織STAT3被磷酸化而激活；與UC組比較，隔藥灸組結腸組織p-STAT3磷酸化水平顯著降低（圖3）。

與正常組比較，UC組結腸組織NF-κB通路中磷酸化pIκB-α和NF-κB p65蛋白表達均顯著增加，IκB-α蛋白表達顯著降低；與UC組比較，隔藥灸組NF-κB p65和磷酸化pIκB-α蛋白表達均顯著降低，IκB-α蛋白表達顯著增加（圖3）。

3 討論

圖3 各組大鼠結腸組織STAT3磷酸化和NF-κB通路蛋白表達的比較

潰瘍性結腸炎臨床表現為腹瀉、腹痛及粘液膿血便等癥狀，病情持久難愈，且易反復發(fā)作，與克羅恩病共稱為炎癥性腸病。根據主癥，當屬中醫(yī)學“腹瀉”、“便血”、“久瀉”、“久痢”、“腸癖”等病癥范疇。課題組前期采用灸補脾胃調和陰陽法治療潰瘍性結腸炎，灸法常取隔藥灸，藥餅主要成分為附子、肉桂、丹參、紅花、木香等，有溫陽散寒和行氣止痛的作用，主穴天樞穴是大腸之募穴，屬足陽明胃經，可疏調腸腑、理氣行滯、消食[22-24]，艾灸天樞穴可改善腸腑功能，緩解腸道功能失常而導致的各種證候，是腹部要穴[16，25，26]。前期研究表明，艾灸在臨床治療潰瘍性結腸炎患者中取得了顯著的療效，其作用機制與艾灸的抗炎免疫調節(jié)機制有關[21，27，28]。本研究采用 DSS誘導的UC，能很好復制潰瘍性結腸炎的癥狀，是UC機制研究中最常用的動物模型，其血清中IL-6及IL-1β等促炎癥因子的蛋白濃度顯著上調，結腸組織HE染色觀察組織病理學，發(fā)現結腸上皮不完整，有潰瘍形成，黏膜和黏膜下層有明顯的炎癥反應；采用隔藥灸干預UC大鼠，其結腸組織病理學觀察發(fā)現，隔藥灸能減輕UC大鼠的結腸炎癥，促進腸黏膜上皮修復，杯狀細胞明顯增多，可降低UC大鼠血清異常增高的IL-6、IL-1β蛋白濃度，從而減輕腸道炎癥反應，提示隔藥灸能緩解DSS誘導的UC大鼠結腸炎癥反應，抑制結腸促炎癥性因子IL-6、IL-1β的釋放。

IBD患者結腸黏膜組織中明顯增加的促炎癥性因子（IL-6、IL-1β）受活化的轉錄因子調節(jié)（如STAT3和NF-κB）。在這項研究中，隔藥灸能抑制DSS誘導的結腸炎小鼠中NF-κB和STAT3 Tyr705的活化和核轉位。大量研究表明，活化的STAT3和NF-κB能促進細胞增殖和血管生成，并上調靶基因（如IL-6、IL-1β）的表達[9，10，29]。IL-6 的刺激可活化 STAT3 的組分，STAT3和NF-κB作用于基因的相同的啟動子區(qū)域，共同調節(jié)相關細胞因子和趨化因子的 mRNA 轉錄[9，14，30，31]。UC大鼠結腸在炎癥刺激下，IκB-α發(fā)生磷酸化而水解，促NF-κB和轉入細胞核內，與靶基因的啟動子區(qū)域結合，上調相關靶基因，激活T輔助細胞免疫應答，進而參與炎癥反應。據報道，STAT3可直接與p65和p50相互作用，促進NF-κB募集至STAT3啟動子，反之亦然。NF-κB的RelA的下游基因編碼的因子能激活STAT3通路；STAT3可通過募集p300組蛋白乙酰轉移酶與RelA結合，干擾NF-κB和IκB-α復合物的形成，持續(xù)激活炎癥相關的基因[32]。STAT3和NF-κB之間的激活和串擾，通常是慢性炎癥作用的結果，特別是T輔助細胞。且NF-κB和STAT3通路已作為潰瘍性結腸炎的潛在治療靶點。本研究結果提示，STAT3 Tyr705的磷酸化與DSS誘導的小鼠的潰瘍性結腸炎有關，說明STAT3活性依賴于酪氨酸磷酸化，而隔藥灸可降低UC結腸組織STAT3酪氨酸磷酸化水平。近期研究表明DSS誘導的結腸炎癥與STAT3Tyr705密切相關，STAT3的絲氨酸磷酸化與JAK活性和STAT3酪氨酸磷酸化無關[7，33]。綜上所述，本研究結果提示，隔藥灸可能通過調節(jié)NF-κB信號通路和STAT3的激活，減少血清促炎癥因子IL-6、IL-1β的釋放，達到減輕DSS誘導的潰瘍性結腸炎癥反應。該結果為臨床進一步應用隔藥灸治療潰瘍性結腸炎提供了客觀的科學依據。