艾灸預處理“天樞”穴對潰瘍性結腸炎大鼠腸黏膜屏障保護的機制研究＊

馬 喆，方臻臻，吳煥淦，顧沐恩，楊 玲，祁 琴，汪 迪，李昆珊，劉慧榮，黃 艷＊＊，陸 嫄＊＊

（1.上海中醫藥大學上海市針灸經絡研究所 上海 200030；2.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院 上海 200437）

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種病因未明的慢性非特異性腸道炎性疾病，與克羅恩?。–rohn's disease，CD）同屬于炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）的范疇，病變部位主要局限于大腸黏膜與黏膜下層，范圍多累及遠端結腸，并可向近端逆行發展，甚至累及全結腸。臨床流行病學資料表明該病的高發地區主要集中在歐美發達國家，中國在內的多數發展中國家為低發病率地區，但是近年來研究發現UC在中國的發病呈逐漸上升趨勢，且南方人群發病率高于北方人群[1，2]。我國1956年報道了第1例UC患者，2006年我國回顧性分析，UC患病率約為11.6/10萬，已經成為我國消化道疾病的主要疾病[3，4]。潰瘍性結腸炎患者臨床表現主要為腹瀉、腹痛及黏液膿血便等癥狀，另外還可表現為皮膚、眼睛、關節和肝膽等腸外癥狀[5，6]。本病遷延不愈，有發生癌變的可能，加重了患者在診療過程中的心理負擔。因此，深入研究潰瘍性結腸炎的發病機制，并尋找有效的治療方法已經成為醫學研究的熱點和難點。目前，UC的病理機制尚未完全闡明。研究表明，在UC的整個病理過程中，腸黏膜屏障作為腸道的重要防線之一，與UC的發病密切相關[7，8]。腸黏膜屏障損傷引起的腸黏膜屏障通透性的增加可能是UC發病的始動因素，由此引發的腸道對細菌、毒素等的吸收增加、機體異常免疫調節及炎癥反應，是UC病情進展的核心環節[9，10]。因此，保護腸黏膜屏障的完整性可能在一定程度上能夠抑制UC的病理進程，并可作為改善UC臨床癥狀的潛在治療方法之一。

圖1 實驗流程圖

“艾灸預處理”即用灸法防病保健，其理論基礎是通過艾灸來疏通經絡氣血，激發人體的正氣，以增加機體抵御外邪、預防或治療疾病的能力，并可在一定程度上減緩各種因素對機體造成的惡性應激，是針灸“治未病”的主要預處理方法之一[11-14]。相對于針刺治療疾病時對“既病防變”的環節的側重，艾灸更加側重于“未病先防”，適宜于疾病的預防[15-18]。課題組前期研究發現艾灸預處理“天樞”穴，能夠調節機體免疫功能而發揮艾灸保健與養生的作用[19]，因此本研究基于前期的研究基礎，探討艾灸預處理對UC腸黏膜屏障保護的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

近交系雄性Sprague Dawley（SD）清潔級大鼠28只，體重180±20 g，由上海中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(滬)2012-0002；飼養環境：12小時晝夜節律交替、室溫20±2℃，室內濕度50%-70%。所有動物適應性飼養一周后采用完全隨機設計方法，分成正常組、模型組、隔藥灸預處理組、溫和灸預處理組，每組7只。所有實驗操作均在上海中醫藥大學動物倫理委員會指導下進行。

1.2 藥物和試劑

DSS（公司：MPBiomedicals，分子量：36000-50000，貨號：9011-18-1，規格：500GM）；艾條、艾絨：南陽漢醫艾絨有限責任公司；藥粉：附子（四川）、肉桂（廣西）、木香（云南）等；黃酒：上海慶豐釀造調味品有限公司。一抗 NF-κb P65（公司：CST，濃度 1∶1000，貨號：8242）；IL-1β（公司：abcam，濃度：1∶500，貨號：ab9722）；Occludin（公司∶abcam，濃度：1∶400，貨號：ab167161）；JAM1（公司∶abcam，濃度：1∶100，貨號：ab180821）；ZO-1（公司∶abcam，濃度：1∶200，貨號：ab190085）MUC2（公司：abcam，即 用 型，貨號：ab76775）；蘇木素：南京建成科技有限公司；伊紅：南京建成科技有限公司；鼠兔通用免疫組化試劑盒：上海威奧生物科技有限公司；封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液：上海威奧生物科技有限公司。

1.3 造模及干預方法

艾灸干預（第1-7天）：隔藥灸預處理組行隔藥灸干預，將藥餅（直徑1 cm、厚度0.5 cm）置于大鼠天樞穴區，上置艾炷（90 mg）施灸，每日1次，每次每穴灸2壯，連續灸7天；溫和灸預處理組行溫和灸干預，采用大鼠實驗專用艾條（直徑7 mm、長120 mm，重2 g）距離天樞穴2 cm處施灸，溫和灸過程中每間隔兩分鐘刮取艾灰一次，每日1次，每次每穴灸10 min，連續灸7天；正常組、模型組不予干預，只做與艾灸預處理組相同的抓取與固定；穴位定位參照李忠仁主編《實驗針灸學》（中國中醫藥出版社，2007年版）；

模型制備（第8-14天）：隔藥灸預處理組、溫和灸預處理組、模型組予4%DSS水溶液連續飲用；正常組不予干預。

1.4 大鼠一般情況觀察

觀察各組大鼠的飲食量、飲水量、精神狀況、皮毛光澤度、大便性狀等大體情況。

1.5 標本的采集和處理

采用2%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（30-40 mg?kg-1）。自恥骨聯合處-盲腸取下結腸，沿腸系膜縱行剖開結腸，予生理鹽水沖洗后，觀察大鼠結腸大體情況，自下而上取6-8 cm結腸段，并截取其中的一段（1 cm）固定于4%多聚甲醛固定液中用于形態學觀察，剩余部分剪碎混合后平均分成2份，置于液氮1小時后，置于-80℃冰箱保存備用。

1.6 HE染色

切片常規脫蠟至水：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各20 min；下行梯度酒精：100%、95%、90%、80%、70%乙醇各5 min；雙蒸水5 min×2次；蘇木素浸染2-3 min，流水沖洗10 min，1%鹽酸酒精分化1-2 s，流水沖洗5 min，伊紅浸染2-3 min；上行梯度酒精：70%、80%、90%、100%乙醇各1-2 s；二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明各15 min；封片，于光學顯微鏡下觀察大鼠結腸黏膜組織形態學變化并評分，評分標準參照Obermeier F等制定的標準[20]。

圖2 大鼠結腸組織病理學觀察及評分

1.7 免疫組化檢測法

取大鼠結腸組織石蠟切片，經脫蠟、水化、抗原修復、封閉后于37℃條件下滴加一抗，4℃冰箱過夜并于第2天滴加二抗孵育。PBS沖洗后用DAB顯色液進行顯色。之后用蘇木素對細胞核進行染色1 min，脫水，封片。在顯微鏡下隨機選擇3-5個視野觀察，以胞漿內發現棕褐色顆粒的細胞作為陽性細胞。每張切片在固定光亮度下，隨機選取3-5個視野進行拍照，采用Image-PlusPro 6.0軟件分析，計算出每張照片的陽性目標陽性面積(Area)和積分光密度(IOD)，求出陽性目標的平均光密度(AOD)(AOD=IOD/Area)，最后取平均值即為該切片的陽性目標平均光密度值。

1.8 免疫印跡檢測法

取大鼠結腸組織，剪碎，加入RIPA裂解液，充分提取蛋白后離心取上清；采用BCA蛋白定量法測定各樣本蛋白濃度，調整各樣本濃度一致變性后，經電泳，轉膜后加入封閉液(5%脫脂奶粉)中室溫封閉1 h，加入對應一抗于脫色搖床上4℃過夜，洗膜后加入二抗孵育1 h，最后于暗室中用X膠片感光、顯影、定影。

1.9 統計學處理

實驗數據采用SPSS21.0統計軟件進行統計學分析。計量資料先作正態性檢驗，符合正態分布用均數±標準差（xˉ±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）法，若方差齊者采用LSD法，方差不齊者采用Dunnett's T3法；不符合正態性分布者以中位數（四分位數）[Median(P25，P75)]表示，組間比較采用非參數檢驗法。所有檢驗采用雙側檢驗，以α=0.05為檢驗水準，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 艾灸預處理對UC大鼠結腸組織炎癥的效應觀察

2.1.1 大鼠一般情況變化

艾灸干預（第1-7天）期間：各組大鼠活動正常，反應靈敏，飲食和飲水量正常，毛發干凈有光澤，肛周無污穢，糞便軟硬適中，飼養籠墊料干燥。

模型制備（第8-14天）期間：正常組大鼠無異常變化；模型組大鼠在飲用DSS水溶液2天之后開始出現喜靜少動、精神萎靡癥狀，飲食和飲水量較正常組有所減少，肛周污穢，糞便不成形、甚有便血，飼養籠墊料易污穢，且上述一般情況的嚴重程度隨著飲用DSS天數的增加逐漸加重；隔藥灸預處理組和溫和灸預處理組大鼠一般情況較模型組比較，出現的時間稍有延遲，且程度較輕。

2.1.2 大鼠結腸組織病理學觀察

光鏡下觀察各組結腸組織HE染色結果，正常組結腸黏膜結構清晰，上皮組織完整，腺體排列整齊，可見大量的杯狀細胞，黏膜固有層可見毛細血管和少量散在的淋巴細胞，無炎性細胞浸潤，未見充血、水腫；模型組結腸黏膜結構不清，上皮脫落，腺體破壞，可見大面積潰瘍，杯狀細胞基本消失，黏膜及黏膜下層有大量炎性細胞浸潤，伴有充血、水腫；隔藥灸預處理組、溫和灸預處理組結腸黏膜結構較為清晰，上皮較為完整，腺體排列較規則，可見小面積潰瘍，杯狀細胞部分消失，黏膜及黏膜下層可見炎性細胞浸潤，伴有輕度充血、水腫（圖2）。

圖3 大鼠結腸組織Occludin蛋白表達

圖4 大鼠結腸組織JAM1蛋白表達

2.2 艾灸預處理對UC大鼠腸黏膜屏障的作用機制研究

2.2.1 各組大鼠結腸組織Occludin免疫組化結果

Occludin蛋白主要表達在上皮細胞和腺體腺上皮細胞的胞漿中。正常組Occludin蛋白大量表達在上皮細胞和腺體腺上皮細胞的胞漿中，陽性表達呈棕褐色，且染色深，分布密集。模型組僅有少量Occludin蛋白表達于上皮細胞和腺體腺上皮細胞胞漿中；隔藥灸預處理組、溫和灸預處理組大鼠結腸組織Occludin蛋白在上皮細胞和腺體腺上皮細胞胞漿中有不同程度的陽性表達；采用平均光密度（IOD/AREA）定量結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠結腸組織Occludin的表達顯著降低，差異有統計學意義（PUC＜0.001）；與模型組比較，隔藥灸預處理組、溫和灸預處理組大鼠結腸組織Occludin的表達均顯著升高，差異均有統計學意義（PHM+P＜ 0.001，PWM+P＜ 0.001）（圖3）。

2.2.2 各組大鼠結腸組織JAM1免疫組化結果

JAM1蛋白連續表達在上皮細胞和腺體腺上皮細胞的胞漿中。正常組JAM1蛋白大量表達在上皮細胞和腺體腺上皮細胞的胞漿中陽性表達呈棕褐色，且染色深，分布密集。模型組僅有少量JAM1蛋白表達于上皮細胞和腺體腺上皮細胞胞漿中；隔藥灸預處理組、溫和灸預處理組大鼠結腸組織JAM1蛋白在上皮細胞和腺體腺上皮細胞胞漿中有不同程度的陽性表達。采用平均光密度（IOD/AREA）定量結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠結腸組織JAM1蛋白表達顯著降低，差異有統計學意義（PUC＜0.001）；與模型組比較，隔藥灸預處理組大鼠結腸組織JAM1蛋白表達升高，差異有統計學意義（PHM+P＜ 0.05）（圖4）。

圖5 大鼠結腸組織MUC2蛋白表達

圖6 大鼠結腸組織ZO-1蛋白表達

2.2.3 各組大鼠結腸組織MUC2免疫組化結果

MUC2蛋白表達于結腸黏膜隱窩的杯狀細胞內和少量上皮細胞內。正常組MUC2蛋白大量表達于結腸黏膜隱窩的杯狀細胞、上皮細胞內，染色陽性結果呈棕褐色；模型組、隔藥灸預處理組、溫和灸預處理組大鼠結腸組織MUC2蛋白染色強度均有不同程度減弱。采用平均光密度（IOD/AREA）定量結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠結腸組織MUC2蛋白表達顯著降低，差異有統計學意義（PUC＜0.001）；與模型組比較，隔藥灸預處理組、溫和灸預處理組大鼠結腸組織MUC2蛋白表達均顯著升高，差異均有統計學意義（PHM+P＜0.001，PWM+P＜ 0.001）（圖5）。

2.2.4 各組大鼠結腸組織ZO-1免疫組化結果

ZO-1蛋白主要表達在上皮細胞和腺體腺上皮細胞的胞漿中。正常組ZO-1蛋白大量表達在上皮細胞和腺體腺上皮細胞的胞漿中，陽性表達呈棕褐色，且染色深，分布密集。模型組僅有少量ZO-1蛋白表達于上皮細胞和腺體腺上皮細胞胞漿中；隔藥灸預處理組、溫和灸預處理組大鼠結腸組織ZO-1蛋白在上皮細胞和腺體腺上皮細胞胞漿中有不同程度的陽性表達；采用平均光密度（IOD/AREA）定量結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠結腸組織ZO-1蛋白表達顯著降低，差異有統計學意義（PUC＜0.001）；與模型組比較，隔藥灸預處理組、溫和灸預處理組大鼠結腸組織ZO-1蛋白表達均顯著升高，差異均有統計學意義（PHM+P＜0.001，PWM+P＜ 0.001）（圖6）。

2.3 艾灸預處理對UC大鼠結腸組織的免疫調節作用機制

2.3.1 各組大鼠結腸組織NF-κB P65蛋白表達

圖7 大鼠結腸組織NF-κB P65蛋白表達

與正常組比較，模型組大鼠結腸組織NF-κB P65蛋白表達顯著升高，差異有統計學意義（PUC＜0.01）；與模型組比較，隔藥灸預處理組大鼠結腸組織NF-κB P65蛋白表達顯著降低，差異有統計學意義（PHM+P＜0.01）（圖7）。

2.3.2 各組大鼠結腸組織IL-1β蛋白表達

與正常組比較，模型組大鼠結腸組織IL-1β蛋白表達顯著升高，差異有統計學意義（PUC＜0.001）；與模型組比較，隔藥灸預處理組、溫和灸預處理組大鼠結腸組織IL-1β蛋白表達均顯著降低，差異均有統計學意義（PHM+P＜ 0.01，PWM+P＜ 0.001）（圖8）。

3 討論

潰瘍性結腸炎臨床表現為腹瀉、腹痛及粘液膿血便等癥狀，病情持久難愈且易反復，與中醫學中“腹瀉”、“便血”、“久瀉”、“久痢”、“腸癖”之證頗為相似。該病發病率高且愈后差，因此，加強本病的防治能夠在一定程度上節約醫療資源和提高患者生活質量。中醫自古就有“治未病”的思想，“艾灸預處理”就屬于其中的代表，它屬于中醫學中“逆灸”的范疇[21]，是一種用灸法預處理用于保健防病的方法，在中醫古籍中有大量關于“逆灸”防病保健的案例與方法，如明·高武在《針灸聚英》里說:“無病而先針灸曰逆，逆，未至而迎之也。”這種艾灸療法被現代醫家和百姓用以養生，既可預防疾病的發生又可既病防變[22]。潰瘍性結腸炎屬于腸腑病，根據腧穴的近治作用，天樞穴定位在臍中旁二寸，居陰陽升降之所，為天地之樞，又為足陽明胃經穴、大腸募穴，對于腸道疾病有較好的治療作用[23-25]。

近年來，艾灸在治療潰瘍性結腸炎的臨床治療中取得了顯著的療效，臨床上應用艾灸治療潰瘍性結腸炎具有明顯的優勢[26-28]。動物實驗研究腸黏膜屏障保護機制揭示了艾灸治療UC的機制，其結果表明艾灸能夠升高腸黏膜屏障相關蛋白（腸上皮閉鎖蛋白和緊密連接蛋白）的表達，通過發揮促進損傷黏膜修復的作用而達到抑制結腸炎的目的[29-31]?；诎闹委烾C的療效優勢和腸黏膜屏障保護的機制研究，本研究從艾灸保護UC腸黏膜屏障的角度出發，結合中醫“治未病”的思想，突出艾灸的“防病”作用，并提出假設，探討艾灸預處理是否可通過加強UC腸黏膜屏障的保護，以減輕機體的炎癥反應來防治UC的發生發展。

腸黏膜屏障主要由機械屏障、免疫屏障、化學屏障、生物屏障四部分構成[32]。本研究觀察了腸黏膜機械屏障中的相關緊密連接咬合蛋白(Occludin)、連接黏附分子(junction adhesion molecule，JAMs)、閉合小環蛋白(ZO-1)等3種關鍵蛋白，結果發現模型組Occludin、JAM1、ZO-1等3種蛋白的表達量顯著降低。既往研究表明腸黏膜機械屏障中的緊密連接在腸屏障中起決定性作用，緊密連接的減少或破壞會導致腸黏膜屏障通透性增加，腸腔抗原攝入也隨之增加，并與免疫細胞相互作用，誘導腸道炎癥反應[33-35]，因此，調節和保護緊密連接蛋白對于UC的防治具有重要意義。本研究采用艾灸預處理的方法觀察艾灸對腸黏膜屏障中緊密連接蛋白的影響作用，結果發現隔藥灸預處理對3種緊密連接蛋白的表達均有升高作用，溫和灸預處理也升高了Occludin、ZO-1的蛋白表達，表明艾灸預處理對腸黏膜機械屏障中相關緊密連接蛋白具有保護作用。

腸上皮表面覆蓋的黏液構成了腸黏膜的化學屏障，主要是由腸道杯狀細胞及腸上皮細胞分泌的黏蛋白(mucin，MUC)所組成，在整個腸黏膜屏障中也起了關鍵作用[36]。MUC2是參與構成腸黏膜屏障最重要的糖蛋白，能夠阻止細菌與腸上皮細胞結合，使細菌留在黏液層并在腸蠕動時被有效清除[37，38]。臨床研究表明UC患者腸黏膜MUC2的表達降低并且與UC病情嚴重程度相關[39]。實驗研究也表明在MUC2缺乏的小鼠發展成了具有UC樣結腸炎的表現，且腸黏膜滲透性的增加導致TNF-α、IFN-γ等炎癥因子的大量產生[40]。本研究組織病理學結果提示模型組大鼠也具有明顯的結腸炎表現，表現為結腸上皮伴有缺損，黏膜結構不清，黏膜及黏膜下層有大量炎性細胞浸潤，腺體破壞，杯狀細胞減少，潰瘍形成；進一步觀察模型組中MUC2的蛋白表達量，結果發現其蛋白表達量顯著降低，且與疾病嚴重程度相關；而在造模前給予隔藥灸預處理和溫和灸預處理的大鼠組織病理學評分較模型組均明顯降低，MUC2蛋白表達量也明顯升高，表明艾灸預處理同樣對MUC2蛋白具有保護作用。

研究表明，腸黏膜屏障的破壞可導致腸黏膜通透性增加，激活機體天然免疫反應，產生大量的炎癥因子，炎癥因子又可形成負反饋調節，進一步加重腸道炎癥反應[41-43]。我們已經證實了艾灸預處理對腸黏膜屏障相關蛋白的保護作用，而這種保護是否能夠形成腸道防線來減輕或抑制UC的炎癥反應呢？因此，我們需要通過評估機體的炎癥反應來驗證腸黏膜屏障的防線作用。NF-κB作為一種核轉錄因子，可以與UC密切相關的細胞因子如（IL-1β）的κB位點結合，促進炎癥因子的基因轉錄，與UC炎癥反應密切相關[44]。通過觀察結腸組織中NF-κB p65和IL-1β的表達，我們發現，隔藥灸預處理明顯降低了這兩種蛋白表達，溫和灸預處理對IL-1β的表達也具有顯著抑制作用，表明艾灸預處理在一定程度上減輕了UC的炎癥反應，這種抑制效應可能正是由于腸黏膜屏障發揮的防線作用來起效的。

綜上，本研究采用DSS成功模擬了UC模型，其病理組織改變符合UC的典型特征。通過觀察艾灸預處理對UC的效應，我們發現因提前采用艾灸干預，在一定程度上緩解了UC大鼠結腸組織炎癥。進一步機制研究發現，隔藥灸預處理、溫和灸預處理均能升高大鼠腸黏膜屏障相關蛋白的表達，可以降低腸黏膜組織中炎癥因子的表達，兩種艾灸預處理的方法在保護腸黏膜屏障和降低炎癥反應中并無明顯差異，表明艾灸預處理可能通過預防腸黏膜屏障中相關蛋白的破壞，保護和維持腸黏膜屏障的完整性和通透性來抑制UC的炎癥反應，且兩種療法均有效，臨床應用中可根據實際情況進行療法選擇。但是，本研究尚存在不足之處，本研究主要對腸黏膜屏障中的機械屏障和化學屏障中的相關蛋白進行了研究，而關于艾灸預處理是否對免疫屏障和生物屏障同樣具有保護作用尚未研究，因此今后可從更多角度深入探討，完善艾灸預處理防治UC的機制研究。