新疆南疆部分地區(qū) 3 種璃眼蜱的分子生物學(xué)鑒定

李凱瑞，李 飛,2，何 波，張路瑤,3，趙 麗,4，劉永宏,4

(1.塔里木大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2.新疆阿克蘇地區(qū)動(dòng)物疫病控制診斷中心，新疆阿克蘇 843000；3.巴里坤哈薩克自治縣畜牧獸醫(yī)工作站，新疆哈密 839200； 4.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300)

蜱隸屬節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)蜘蛛綱(Arachnida)螨亞綱(Acari)寄螨總目(Parasitiformes)蜱目(Ixodida)蜱總科(Ixodoidea)，是一類專性吸血的體外寄生蟲，能寄生包括人在內(nèi)的多種脊椎動(dòng)物[1-2]。對(duì)宿主最直接的危害為生產(chǎn)性能降低和增量變慢，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致死亡。除直接危害，蜱也是傳染性動(dòng)物疾病最常見的媒介，能夠傳播多種病原，包括細(xì)菌、病毒、血液原蟲、螺旋體和立克次體等，對(duì)人類、寵物、野生動(dòng)物和牲畜構(gòu)成嚴(yán)重威脅，在很大程度上給診斷和防治帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[3-4]。

全世界蜱類大約900多種，分為3個(gè)科：硬蜱科(Ixodidae)、軟蜱科(Argasidae)和納蜱科(Nuttalliellidae)。硬蜱科中的璃眼蜱屬(Hyalomma)包括3個(gè)亞屬，共有27個(gè)種。中國的璃眼蜱均屬于同一亞屬，已記載的有9個(gè)種[5-6]。新疆是中國陸地面積最大的省級(jí)行政區(qū)，占中國總面積的1/6，無論是地理氣候，還是牲畜種群，都為蜱提供良好的生存環(huán)境，其中天山橫亙于新疆中部，把新疆分為南疆和北疆，璃眼蜱屬是南疆的優(yōu)勢(shì)蜱屬之一[7]。

蜱類的鑒定主要有形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，后者近年在系統(tǒng)分類學(xué)中的應(yīng)用越來越廣泛[8]。常用鑒定基因有：核糖體RNA基因，分為18S rRNA、28S rRNA、5.8S rRNA、非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(NTS)、轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)和基因間隔區(qū)(IGS)；線粒體DNA，分為12S rRNA、16S rRNA、細(xì)胞色素氧化酶、細(xì)胞色素b、22個(gè)tRNA和2個(gè)ATP酶基因[9-10]。線粒體DNA中的12S rDNA和16S rDNA通常用來分析蜱的種間變異、種內(nèi)變異和種群水平，在多個(gè)蜱種中均有應(yīng)用[11-13]。這2個(gè)基因均較保守，相比于其他同類基因進(jìn)化速率不高，可以被通用引物或者保守引物PCR擴(kuò)增，16S rDNA在蜱的分類系統(tǒng)進(jìn)化分析中擴(kuò)增序列可獲得更多位點(diǎn)信息，擴(kuò)增的物種也更多[14]。本研究通過12S rDNA和16S rDNA進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，確定南疆部分地區(qū)璃眼蜱分布情況，為蜱傳病的流行病學(xué)調(diào)查及疫病風(fēng)險(xiǎn)防控工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 蜱 共采集559只璃眼蜱屬蜱，采集時(shí)間、地點(diǎn)和分布見表1。

表1 蜱的來源Table 1 Source of ticks collection

1.1.2 主要試劑及儀器 TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0 (Code No. 9765)、PremixTaqTM(TaKaRaTaqTMvesion 2.0)(Code No. R004A)和DNA marker DL2000(Code No. 3427A)購自寶生物工程(大連)有限公司。PCR儀(TC-5000，Bibby scientific Ltd)，小型高速冷凍離心機(jī)(R134a, Hermetically sealed refigeration system)，電泳儀(DYY-12，北京市六一儀器廠)，紫外分析儀(JY02S，北京君意東方電泳儀設(shè)備有限公司)等。

1.1.3 線粒體 12S rDNA和 16S rDNA基因擴(kuò)增引物 蜱類線粒體12S rDNA和16S rDNA特異性基因片段PCR擴(kuò)增引物[15-16]由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見表2。

1.1.4 蜱物種鑒定參考序列 亞洲璃眼蜱、小亞璃眼蜱和殘緣璃眼蜱物種鑒定所選取的參考序列見表3。

表2 蜱 12S rDNA和 16S rDNA基因片段擴(kuò)增引物Table 2 Primers for amplification of 12S rDNA and 16S rDNA gene fragments of ticks

注： W 對(duì) A 或 T(W 為兼并引物，表明該位置2種堿基擇1)。

Note：W pairs A or T (W is merger primer to indicate location of two bases).

表3 蜱物種鑒定參考序列Table 3 sequences for identification of tick species

1.2 方 法

試驗(yàn)在新疆阿拉爾市塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院和新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2.1 蜱樣本篩選 收集新疆南疆蜱蟲樣本，通過形態(tài)學(xué)鑒定初步篩選出璃眼蜱屬蜱做好標(biāo)記，用蒸餾水反復(fù)沖洗掉體表的異物，置于滴加甘油的φ=75%酒精中保存，供鑒定，其他于-20 ℃保存，備用。

1.2.2 蜱DNA提取 選取要鑒定的璃眼蜱樣本，將蜱依次在φ=50%、φ=30%、φ=10%的酒精、自來水和蒸餾水中各浸泡1 h。清洗潔凈后，剪成小塊置于EP滅菌管中，根據(jù)TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction KitVer. 5.0試劑盒說明提取蜱組織DNA。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定根據(jù)TakaRaTaqTMVersion 2.0試劑盒說明設(shè)置12S rDNA和16S rDNA基因PCR反應(yīng)體系，具體見表4。

表4 PCR 反應(yīng)體系Table 4 PCR reaction system

12S rDNA基因PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性15 s，51 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性15 s，53 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)；70 ℃延伸5 min。

16S rDNA基因PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，49 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，47 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，45 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，43 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸5 min。

1.2.4 電泳及凝膠成像觀察 取5 μL PCR產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并記錄。

1.2.5 測(cè)序及序列分析 將PCR陽性產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，利用鄰接法(Neighbor-joining method, NJ)將測(cè)序結(jié)果與亞洲璃眼蜱、小亞璃眼蜱和璃眼蜱屬其他序列，以及圖蘭扇頭蜱(Rhipicephalusturanicus)、血紅扇頭蜱(Rhipicephalussanguineus)、波斯銳緣蜱(Argaspersicus)、銳跗硬蜱(Ixodesacutitarsus)和蠕形螨(Demodexcanis)作為外緣種(Outgroup)進(jìn)行同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增

提取經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為璃眼蜱屬13只蜱的基因組DNA， 對(duì)12S rDNA和16S rDNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由圖 1 和圖 2 可知，試驗(yàn)陰、陽性對(duì)照成立，且樣品獲得目的片段與預(yù)期大小一致。初步分析12S rDNA和16S rDNA基因均成功擴(kuò)增，蜱種類確定需要結(jié)合測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

M. DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) DL2000 DNA marker DL2000; 1.陽性對(duì)照 Positive control; 2. 陰性對(duì)照 Negative control; 3～10. 12S rDNA 基因 12S rDNA gene

M. DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) DL2000 DNA marker DL2000; 1～8. 16S rDNA 基因 16S rDNA gene; 9. 陰性對(duì)照 Negative control; 10. 陽性對(duì)照 Positive control

2.2 12S rDNA序列分析

基于璃眼蜱12S rDNA基因擴(kuò)增片段，13段自測(cè)序列間的同源性為85.7%～99.7%。1、5、7、11、13的同源性較高，2、3、4、8、9、10、12的同源性較高，6與其他序列的同源性均較低(表5)。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果認(rèn)為：1、5、7、11、13為同一種璃眼蜱，2、3、4、8、9、10、12為同一種璃眼蜱，6為單獨(dú)一種璃眼蜱。

表5 基于璃眼蜱 12S rDNA基因的13段自測(cè)序列同源性比對(duì)Table 5 Homology comparison of 13 self test sequences based on 12S rDNA gene fragments of Hyalomma

同源性分析結(jié)果顯示，序列8與小亞璃眼蜱(登錄號(hào)：KF583616)同源性為100%，2、3、4、9、10和12與小亞璃眼蜱(登錄號(hào)：KF583616)同源性均為99%；6與亞洲璃眼蜱(登錄號(hào)：KF583591)同源性為98%；1和13與殘緣璃眼蜱(登錄號(hào)：KF583607)同源性為99%，5、7和11與殘緣璃眼蜱(登錄號(hào)：KF583607)同源性為98%。系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系顯示，1、5、7、11、13與殘緣璃眼蜱位于同一個(gè)進(jìn)化支上；2、3、4、8、9、10、12與小亞璃眼蜱位于同一個(gè)進(jìn)化支上；6與亞洲璃眼蜱位于同一個(gè)進(jìn)化支上，且與不同屬的扇頭蜱和其他外圍群處于不同分支(圖3)。進(jìn)化樹中，同一屬或同一種的璃眼蜱均能聚為一支，12S rDNA基因可以為這3種璃眼蜱提供分類依據(jù)。綜合序列分析結(jié)果及形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，可以確定此次采集的璃眼蜱屬于樣本殘緣璃眼蜱、小亞璃眼蜱和亞洲璃眼蜱。

2.3 16S rDNA序列分析

測(cè)序結(jié)果顯示，序列2(阿克蘇地區(qū)庫車縣)和10與小亞璃眼蜱(登錄號(hào)：JX051108)同源性分別為98%和99%，6與亞洲璃眼蜱(登錄號(hào)：KU880611)同源性為99%。

系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系顯示，2和10與小亞璃眼蜱位于同一個(gè)進(jìn)化支上；6與亞洲璃眼蜱位于同一個(gè)進(jìn)化支上，且與同屬不同種的其他璃眼蜱、不同屬的扇頭蜱及其他外圍群處于不同分支(圖4)。進(jìn)化樹中，同一屬或同一種的璃眼蜱均能聚類，表明16S rDNA基因可以為小亞璃眼蜱和亞洲璃眼蜱提供分類依據(jù)。

3 討 論

近年來，關(guān)于蜱類的研究越來越深入和廣泛。在蜱實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng)[17]及制備蜱疫苗候選抗原[18]等諸多研究中，蜱準(zhǔn)確分類鑒定是前提和基礎(chǔ)。形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果容易受到外界因素影響，如蜱樣本不完整或處于不同的發(fā)育階段、鑒定人員經(jīng)驗(yàn)不足、以及形態(tài)非常相似的其他隱藏種和姐妹種等，都會(huì)影響鑒定的準(zhǔn)確性[19]。目前，常用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)方法進(jìn)行蜱種類鑒定，從分子水平提高鑒定的準(zhǔn)確性，可為蜱類分布提供可靠依據(jù)。本研究基于12S rDNA和16S rDNA基因，將新疆南疆部分地區(qū)形態(tài)學(xué)鑒定的璃眼蜱屬蜱鑒定為3種。

另一方面，蜱類分布可能會(huì)因當(dāng)?shù)貧夂颉⒌乩矸指艉蜌v史上的國際牲畜貿(mào)易而發(fā)生變化[20]。璃眼蜱屬中小亞璃眼蜱(Hyalommaanatolicum)、亞洲璃眼蜱(Hyalommaasiaticum)和殘緣璃眼蜱(Hyalommadetritum)不同地區(qū)分布均有差別[21]。王冰潔[22]在新疆哈密、克拉瑪依等多個(gè)地區(qū)的調(diào)查中得出璃眼蜱的區(qū)系分布指數(shù)由低到高為：亞洲璃眼蜱(H.asiaticum)、殘緣璃眼蜱(H.detritum)和小亞璃眼蜱(H.anatolicum)。劉繼榮等[23]發(fā)現(xiàn)在吉木薩爾縣、木壘縣、布爾津縣和石河子莫索灣等地均有小亞璃眼蜱(H.anatolicum)、亞洲璃眼蜱(H.asiaticum)和殘緣璃眼蜱(H.detritum)分布。蜱在當(dāng)?shù)胤植嫉南到y(tǒng)性調(diào)查對(duì)蜱種群分布變化、新種發(fā)現(xiàn)和蜱傳病的流行病學(xué)評(píng)估等至關(guān)重要[24]。本研究確定巴音郭楞蒙古自治州和靜縣、阿克蘇地區(qū)庫車縣、新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第三師50團(tuán)、阿克蘇地區(qū)阿瓦提縣、吐魯番地區(qū)鄯善縣分布有小亞璃眼蜱；阿克蘇地區(qū)溫宿縣分布有亞洲璃眼蜱；喀什地區(qū)莎車縣、和田地區(qū)皮山縣、阿克蘇地區(qū)溫宿縣、和田地區(qū)策勒縣、和田地區(qū)和田縣分布有殘緣璃眼蜱。調(diào)查結(jié)果為新疆南疆部分地區(qū)蜱及蜱傳病的防控奠定基礎(chǔ)。

圖3 12S rDNA基因核苷酸序列NJ法種系發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of 12S rDNA gene nucleotide sequence by NJ method

圖4 16S rDNA基因核苷酸序列NJ法種系發(fā)育進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene nucleotide sequence by NJ method