桃果實番茄紅素β-環化酶基因的克隆及表達分析

梁敏華，楊震峰，蘇新國，宋春波

(1.廣東食品藥品職業學院 食品學院，廣州 510520；2.浙江萬里學院 生物與環境學院，浙江寧波 315100；3.華南農業大學 園藝學院，廣州 510640)

桃(PrunuspersicaL.)，原產于中國，為薔薇目薔薇科多年生大型木本植物，其果實色、香、味俱全，營養豐富。按照果實色澤分類，現在市場上的桃果實可分為白肉桃、紅肉桃和黃肉桃，其中黃肉桃果實中的主要色素成分為類胡蘿卜素[1]。類胡蘿卜素是一類天然植物色素的總稱，共軛雙鍵的分子結構使得其在可見光條件下可呈黃、橙、紅3種顏色或以上3種顏色的混合色[2-3]。

番茄紅素β-環化酶(lycopene β-cyclase，LCYb)是催化類胡蘿卜素中間產物番茄紅素向β-胡蘿卜素或其他含β環的類胡蘿卜素組分轉化的關鍵限速酶[4]。近年來，越來越多的研究表明隨著果實發育成熟進程的推進，果實中番茄紅素或含β環的類胡蘿卜素含量變化與LCYb基因的表達密切相關[5-7]。研究表明，成熟時期的黃肉桃果實，其類胡蘿卜素的主要組分為β-胡蘿卜素、β-隱黃素、葉黃素和玉米黃素等[1, 8]。目前，有關桃果實中LCYb基因表達與β-胡蘿卜素和β-隱黃素等含β環類胡蘿卜素含量積累之間聯系的研究鮮有報道，桃果實中LCYb基因的分離和鑒定研究也尚未見報道。因此，本試驗以黃肉品種桃果實為試材，采用基因克隆技術從桃果實中獲得LCYb基因全長序列，通過實時熒光定量PCR分析其在果實不同發育階段的表達情況，為闡明其在桃果實類胡蘿卜素生物合成與積累過程的分子作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 產自浙江奉化的黃肉品種桃果實‘金麗’是本試驗主要材料。當果實發育處于盛花后35～45 d、55～65 d、95～105 d、105～120 d、120～150 d 5個階段，也就是果實分別發育至軟核期、硬核期、膨大期、硬熟期和完熟期時進行采樣，分別選取大小均勻、無蟲害及無機械損傷的果實進行試驗。

1.1.2 主要試劑 美國Omega公司的植物RNA提取試劑盒用于提取桃果實總RNA；北京康為世紀公司的反轉錄第1鏈cDNA合成試劑盒用于合成反轉錄第1鏈cDNA；日本TaKaRa公司的3′、5′-Full RACE cDNA試劑盒用于擴增目的基因3′、5′末端序列；美國Thermo公司的實時熒光定量PCR試劑盒用于檢測目的基因的表達情況。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取與反轉錄第1鏈cDNA合成 桃果實果皮和果肉總RNA的提取采用Omega公司的植物RNA提取試劑盒并按說明操作。在提取總RNA的過程中，為防止總RNA中混雜的微量DNA對后續試驗的干擾，加入適量無Rnase活性的DNaseⅠ酶液。反轉錄第1鏈cDNA的合成采用康為世紀公司的反轉錄第1鏈cDNA合成試劑盒并按說明操作。

1.2.2 LCYb基因序列克隆與生物信息學分析 NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)用于搜索與桃果實LCYb氨基酸序列同源性較高的其他植物物種LCYb氨基酸序列。比對查找上述氨基酸序列的保守區域，并通過在線軟件(http://blocks.fhcrc.org/blocks/make_blocks.html)在上述保守區域設計簡并引物(表1)。以反轉錄第1鏈cDNA為模板，采用簡并引物法PCR擴增LCYb基因中間核苷酸序列片段，PCR程序如下：94 ℃預變性2 min，然后進行33個循環(94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min)，72 ℃延伸2 min。PCR產物經凝膠分離、凝膠回收純化、連接、大腸桿菌轉化及測序后得到基因的中間核苷酸序列片段。采用TaKaRa公司的3′、5′-Full RACE cDNA試劑盒，按照說明，以簡并引物法得到的LCYb基因核苷酸序列片段為模板分別設計LCYb基因3′、5′末端序列擴增特異性引物(表1)進行3′、5′末端序列PCR擴增。PCR產物同樣經凝膠分離、凝膠回收純化、連接、大腸桿菌轉化及測序后得到LCYb基因3′、5′末端核苷酸序列片段。

表1 試驗所用引物Table 1 Primers used in this study

注Note:*R=A/G；Y=C/T。

1.2.3 LCYb基因生物信息學分析 基因全長cDNA序列拼接采用DNAMAN5.2.2軟件。基因編碼區、編碼基因、蛋白性質預測采用ExPASy在線軟件(http://web.expasy.org)。氨基酸序列比對分析采用NCBI數據庫及GeneDoc2.7.0軟件。蛋白亞細胞定位及二級結構預測采用在線軟件Predictprotein(https://www.predictprotein.org)。蛋白三級結構預測及展示采用SWISS-MODEL服務器(http://swissmodel.expasy.org)。基因系統進化樹分析采用MEGA 5.1 軟件。

1.2.4 實時熒光定量PCR 基因表達情況分析采用美國Thermo公司的實時熒光定量PCR試劑盒進行。按照試劑盒操作說明，以上述克隆所得LCYb基因全長核苷酸序列的編碼區序列為模板設計實時熒光定量PCR引物(表1)。分別加入1 μL cDNA、1 μL上游引物(100 μmol/L)、1 μL下游引物(100 μmol/L)、13 μL SYBR Green PCR混合液、9 μL DEPC水混合成25 μL PCR反應體系。95 ℃預變性7 min，然后95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，重復上述步驟40次。以PpTEF2作為內參基因[9]，每個反應設置3次生物學重復，并進行陰性對照。

1.2.5 數據分析 采用2-ΔΔCT法對目的基因進行表達分析，不同批次及不同果實組織中基因的表達情況比較采用Duncan’s新復極差法進行顯著性分析(P≤0.05)，采用OriginPro 9.0軟件對試驗結果進行作圖。

2 結果與分析

2.1 LCYb基因的克隆與凝膠分析

通過簡并引物法得到的LCYb基因凝膠電泳條帶清晰，測序得到長度為606 bp的序列片段(圖1)。通過3′RACE擴增技術得到LCYb基因3′端PCR擴增產物，PCR產物凝膠電泳條帶稍暗，經后期純化富集測序仍能得到長度為706 bp的序列片段(圖1)。通過5′RACE擴增技術得到的LCYb基因3′端凝膠電泳條帶清晰，測序得到長度為1 027 bp的序列片段(圖1)。準確拼接上述3段序列得到桃果實LCYb基因的全長序列，長度為1 699 bp。通過調用NCBI數據庫現有序列數據進行BLAST比對顯示，上述克隆獲得的LCYb基因全長序列與玫瑰LCYb基因(NCBI搜索號：KP768074)和草莓LCYb基因(NCBI搜索號：JN979375)全長序列同源性分別達88%和86%，因此將它命名為PpLCYb。具體克隆成果已上傳至NCBI數據庫，搜索號為KJ789377。

M.100 bp DNA Marker；1.RT-PCR產物 The product of RT-PCR；2.3′RACE產物 The product of 3′RACE；3.5′RACE產物 The product of 5′RACE

2.2 LCYb基因生物學分析

2.2.1 基本理化性質分析PpLCYb基因具有完整的基因編碼區，長度為1 515 bp，編碼504個氨基酸，呈酸性的天冬氨酸、谷氨酸個數為54個，呈堿性的精氨酸、賴氨酸個數為61個，等電點為8.76，呈弱堿性。所編碼的蛋白分子式為C2587H4011N689O719S25，分子質量為57.1 ku，性質不穩定，脂溶指數85.32，親水指數-0.163，易溶于水。

2.2.2 氨基酸序列比對與功能結構域分析 通過NCBI數據庫從其他植物物種中在線搜得到9條與PpLCYb基因編碼的氨基酸同源性較高的氨基酸序列。氨基酸序列比對及功能結構域預測分析結果如圖2，在PpLCYb基因編碼的氨基酸序列上同樣存在著所有LCYb基因編碼的氨基酸序列所擁有的共同特征結構域(第61～502位氨基酸)，這段特征結構域屬于SDR超級家族。第89～453位氨基酸屬于番茄紅素環化酶蛋白特征編碼區，如LCYb和ε-環化酶等，其中第287～292位氨基酸存在著LCYb特征序列(LYAMPF)，第363～381位氨基酸為NAD(P)/FAD結合區。

2.2.3 基因系統進化樹分析 采用BLAST軟件將PpLCYb基因編碼的氨基酸序列與已在NCBI數據庫發表的其他植物物種LCYb氨基酸序列進行系統進化樹分析，結果顯示(圖3)，PpLCYb與同屬薔薇目的草莓FaLCYb(gi|498663613)聚類于一個小分支內，親緣性好，可信度高。

2.2.4 蛋白亞細胞定位與二、三級結構分析 亞細胞定位預測顯示PpLCYb蛋白定位在葉綠體上，但可信度僅為67%，后期仍需做進一步的試驗分析驗證。二級構件中α-螺旋元件占30.36%，無規則卷曲元件占58.93%，β-折疊元件占10.71%，其中無規則卷曲元件占主要比例，β-折疊元件占比較少，這與使用SWISS-MODEL服務器預測得到的蛋白質三級結構結果基本吻合(圖4)。

2.3 PpLCYb基因在桃果實不同發育組織中的表達分析

由表1設計好的實時熒光定量PCR引物所引發的PCR擴增，擴增效率為95%，處于90%～110%合理范圍區間，擴增產物溶解曲線在溫度為84.5 ℃時出現溶解單峰，擴增特異性強，以上數據表明設計好的實時熒光定量PCR引物可用于桃果實PpLCYb基因表達情況分析。在桃果實整個發育期間，PpLCYb基因無論在果實果皮還是果肉中均有表達(圖5)。隨著桃果實發育進程的推進，PpLCYb基因在果實中的表達總體呈現上升的趨勢，并在果實處于硬熟期時達到較大值，隨后在完熟期略有下降，但在這個過程中，PpLCYb基因在果皮和果肉中的表達無顯著性差異(P>0.05)。以上結果初步表明，PpLCYb基因的表達與果實發育成熟程度在果實發育前期(軟核期、硬核期、膨大期、硬熟期)是呈正相關的，PpLCYb基因可能誘導了桃果實的發育成熟。

a.蛋白功能結構域預測 Protein functional domains prediction；b.基酸序列同源性比較 Homology comparison of putative amino acids’sequence

圖3 桃果實PpLCYb基因系統發生樹Fig.3 Phylogenetic trees of PpLCYb gene

圖4 桃果實PpLCYb蛋白的三維結構預測Fig.4 The deduced three-dimensional structure of PpLCYb protein

相同字母表示在0.05水平上差異不顯著 The same letter means non-significant difference at 0.05 levels

3 討 論

目前，已從與桃果實同屬薔薇目薔薇科的草莓(Fragariaxananassa)(NCBI搜索號：JN979375)、枇杷(Eriobotryajaponica)(NCBI搜索號：JX089591)、歐李(Prunushumilis)(NCBI搜索號：KR866276)、蘋果(Malusdomestica)(NCBI搜索號：KU508827)等果實中分離出LCYb基因全長序列，它們長度普遍處于1 650～1 900 bp之間，編碼495～505個氨基酸。研究發現，植物中LCYb基因是一個大家族，不同物種中LCYb所編碼的氨基酸序列也有很大差異[10]，這種現象在本研究中也同樣存在，研究結果顯示不同植物物種LCYb所編碼的氨基酸序列N端差異性比較大(圖2)，這可能是不同植物進化的結果。但盡管如此，靠近序列C端依然存在幾個高度保守區域，如所有植物LCYb所固有的特征結構域LYAMPF和NAD(P)/FAD結合區等，這些高度保守的結構域被認為與酶的特異性催化功能密切相關[11-12]。本研究首次從桃果實中克隆得到PpLCYb基因全長序列，長度為1 699 bp，編碼504個氨基酸，氨基酸序列比對及功能結構域預測分析顯示其上同樣存在著LCYb特征結構域和NAD(P)/FAD結合域，這表明本研究的克隆分析結果客觀可信。

LCYb是控制類胡蘿卜素中間產物番茄紅素發生環化作用的重要限速酶，LCYb基因表達水平增高能加快β-胡蘿卜素或其他含有β環結構的類胡蘿卜素的積累，LCYb基因表達水平降低則會導致番茄紅素的積累[13]。Ambrosio等[14]通過基因工程技術誘導番茄果實中LCYb基因進行超量表達，結果發現果實中大量積累β-胡蘿卜素。紅肉品種柑橘發育過程中，果實果皮和果肉中LCYb基因的表達水平較低，這可能與果實中番茄紅素的大量積累有關[15-17]。Wisutiamonkul等[18]研究發現在25 ℃貯藏條件下，‘Chanee’榴蓮果實總類胡蘿卜素、β-胡蘿卜素和玉米黃素的含量與果實中LCYb基因的表達呈顯著正相關。增強黃肉品種番木瓜中LCYb基因的表達，果實中番茄紅素含量一直保持較低的水平，而β-胡蘿卜素和β-隱黃素的含量則顯著增高，此外，抑制紅肉品種番木瓜中LCYb基因的表達，果實中番茄紅素含量持續增加，β-胡蘿卜素和β-隱黃素的含量則基本保持較低水平[19]。本試驗結果顯示，隨著桃果實發育成熟進程的推進，PpLCYb基因在果實中的表達逐漸增高并在果實發育處于硬核期時達到較大值，隨后在果實完熟期時略有下降。這表明PpLCYb基因的表達與果實發育成熟過程是基本上呈正相關的，PpLCYb基因可能參與到果實成熟過程中色澤品質的調控環節，但具體分子作用機制有待進一步的試驗驗證。

4 結 論

本試驗首次從桃果實中成功克隆PpLCYb基因，生物信息學分析結果與其他物種已報道的LCYb基因信息基本一致，但上述預測分析結果有待進一步的試驗驗證。PpLCYb基因的表達與果實的成熟程度基本呈正相關，數據表明其可能參與到類胡蘿卜素生物合成的調控過程中。以上結果可為后續PpLCYb蛋白功能鑒定、結構分析以及桃果實采后貯藏過程中類胡蘿卜素的合成調控等試驗研究提供一定的理論依據。