關于氨基酸分離的創新層析實驗的探究

朱彩瑜 趙雨彤 劉先俊 朱勇 汪長東

摘要：通過對創新層析實驗的結果分析，對實驗中出現的異常現象的討論，給出了對該創新層析實驗合理性的評價以及提高實驗可行性的相關建議，可為其他物質的分離提供參考。

關鍵詞：氨基酸；層析；異常現象

中圖分類號：Q52 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2019）01-0274-05

一、引言

物質的分離常用到色譜分析的方法，而以往色譜分析的固定相往往是固定不動的，只有流動相才會運動，如薄層色譜以硅膠、氧化鋁等為固定相，離子交換色譜以離子交換填料為固定相[1-4]。本實驗利用水相與流動相流動速度的差異作為結果判斷依據，采取以流動物質水為固定相的紙層析法來分離氨基酸。由于濾紙中纖維素分子含大量羥基，因而纖維素也具有硅膠的部分性質，其親水性強，能吸收約22%的水分[5]形成流動固定相。

運用紙層析法分離物質，試樣無需經過預處理，方法簡便，儀器廉價，可用于染料、農藥、醫藥、中草藥等的有效成分的分離分析[5，6]，對日常生產生活具有深刻的意義。

二、實驗過程

（一）實驗原理

轉氨基是氨基酸代謝過程中的一個重要反應。每種轉氨基反應均由專一的轉氨酶催化，轉氨酶廣泛分布于機體各組織、器官。在轉氨酶的催化下，氨基酸的α氨基與α酮酸的α酮基的互換反應稱為轉氨基作用。

本實驗用紙層析法觀察-酮戊二酸與丙氨酸在肝臟谷丙轉氨酶（ALT）催化下的轉氨基作用。

實驗分為測定組與對照組。測定組發生轉氨基反應，在最后的體系中存在有兩種氨基酸；而對照組不發生轉氨基反應，最后體系中只有反應物中一種氨基酸。用煮沸方法使得谷丙轉氨酶（ALT）失活而終止反應，然后用紙層析法對兩種氨基酸進行分離鑒定。

紙層析法按操作方法分成兩類即垂直型和水平型。垂直型是將濾紙條懸掛，使流動相向上或向下擴散。水平型是將圓形濾紙置于水平位，溶劑由中心向四周擴散。紙層析法的分離原理是分配層析，分配層析是利用混合物在兩種或兩種以上的不同溶劑中分配系數的不同而使物質分離的方法，相當于一種連續的萃取過程。本實驗采取水平型紙層析法，以濾紙為支撐介質，水被吸附在濾紙的纖維之間形成固定相。某些與水不相溶的有機溶劑如醇、酚等為常用的流動相。把預分離的物質加在紙的一端，使流動溶劑經此向另一端移動，這樣物質隨著流動相的移動進行連續、動態的不斷分配。由于物質分配系數的差異[7]，移動速度就不一樣，在固定相中分配趨勢較大的組分，隨流動相移動的速度就慢；反之，在流動相分配趨勢較大的成分，移動速度就快，而水項流動速度最慢，最終不同的組分彼此分離，水相與流動相流動速度的差異可作為結果判斷依據。物質在紙上移動的速率可以用比移值（Rf）表示[8，9]：物質在一定的溶劑中的分配系數是一定的，故比移值（Rf）也相對恒定，因此在同一層析體系中可用Rf值來鑒別被分離的物質[10]。用紙層析法分離氨基酸混合物時，影響Rf值的主要因素是側鏈基團的極性。例如丙氨酸側鏈極性要小于谷氨酸側鏈的極性，所以混合物中丙氨酸在濾紙上運動要快，Rf值大；反之谷氨酸在濾紙上運動慢，Rf值小。

（二）實驗材料與儀器

1.儀器：剪刀；鑷子；托盤；培養皿；表面皿；毛細管；吹風機；水浴箱；烘箱。

2.試劑：（1）pH7.4 0.01mol/L磷酸緩沖液；

（2）0.2mol/L丙氨酸溶液；（3）0.1mol/L α-酮戊二酸溶液；（4）0.1mol/L谷氨酸溶液；（5）0.5%茚三酮溶液；

（6）層析溶液：乙醇和蒸餾水的混合液（（體積比）乙醇：蒸餾水=3∶1）。

（三）實驗步驟

1.肝勻漿制備：取新鮮的動物肝臟0.5g，在研缽中剪碎，研成勻漿，加入9倍體積（4.5ml）pH7.4 0.01mol/L磷酸緩沖液。

2.轉氨基反應：取干燥小試管（或離心管）二支，分別標明測定管與對照管，各加入肝勻漿10滴，測定管加入37℃水浴保溫10min，對照管放入沸水浴中煮10min，待對照管冷卻后，于兩試管中分別加入0.1mol/L丙氨酸10滴，0.1mol/L α-酮戊二酸10滴，pH7.4 0.01mol/L磷酸緩沖液1.5ml，搖勻，放進37℃水浴保溫30min，保溫完畢，立即將測定管放入沸水浴中煮沸10min以終止反應，取出冷卻后，過濾。取濾液備用。

3.層析：取直徑9cm圓形濾紙一張，用圓規作半徑1cm同心圓，通過圓心作兩條相互垂直的線，在1、3兩處分別點測定管和對照管上清液1—2滴。方法是用毛細管在紙上點樣，注意斑點不可太大（一般為直徑0.5cm）而且每點一滴需干燥后方可再點第二滴，在2、4兩處則各加0.1mol/L丙氨酸和0.1mol/L谷氨酸1—2滴。

在濾紙圓心處打一小孔（如鉛筆芯大小）另取同類型濾紙約1cm2，下半剪成須狀，卷成圓筒，如燈芯，插入小孔（勿使突出濾紙面）。

將層析溶劑放入直徑3—5cm的表面皿正中，（表面皿放入直徑9cm的培養皿正中）將濾紙平放在培養皿上，燈芯浸入溶劑中，將另一同樣大小培養皿反蓋上，可見溶劑沿燈芯上升到濾紙，在向四周擴散，約25min后，溶劑前緣距濾紙邊緣約1cm時即可取出，在60℃烘箱中烤干。

4.顯色：將上述濾紙平放在培養皿上，噴上0.5%茚三酮溶液，使濾紙全部潤濕再在60℃烘箱干燥之，此時可見紫色斑出現，比較色斑的位置及色澤深淺，計算Rf值，分析是否發生了轉氨基反應。

（四）注意事項

第一，操作中接觸濾紙前要洗手擦凈，并盡量避免手與濾紙中間部位接觸。

第二，點樣點不宜過大，直徑小于0.5cm。

（五）實驗結果

顯色數天后，發現顯色條帶繼續擴散，1號位中間原本清晰的條帶已經模糊了，且丙氨酸的顯色條帶脫色嚴重。

三、討論分析

（一）確定測定管成分

由式（1）可得實驗結果中各色斑Rf計算值如表4。

由上表可得，故對照組中應為丙氨酸顯色，測定管兩色斑中Rf值分別與丙氨酸和谷氨酸相近，故測定管距原點較遠的顯色帶應為丙氨酸，距原點較近的顯色帶應為谷氨酸。

進一步分析，測定管是在37肝勻漿加入丙氨酸，而肝勻漿中的轉氨酶能將丙氨酸的氨基轉移至-酮戊二酸，生成谷氨酸，當反應終止時，丙氨酸并未完全反應，故測定管中顯色帶有兩條，分別為丙氨酸與谷氨酸。由于谷氨酸的側鏈為-COOH，增大了氨基酸的極性，使其在水中分配系數較大，更傾向于與固定相結合，故移動程度不大，Rf值較小；丙氨酸的側鏈為-CH3，疏水親脂，所以在流動向中分配系數較大，更容易隨流動相往前移動，Rf值比谷氨酸大。

（二）異常現象探討及改進建議

1.顯色帶異常蝴蝶狀現象。由表1中實驗結果圖可見，該實驗所得5條顯色帶均為蝴蝶狀，而非正常弧形，這會給實驗Rf值的確定帶來誤差。由圖不難發現，每條顯色帶向外伸出部分均位于圓形濾紙折痕處，故筆者分析，是由于濾紙中折痕的存在影響了固定相及流動相在濾紙上流動的速度，造成折痕處與周圍處液相流動不均，使顯色帶呈蝴蝶狀。由此可推測，在該創新實驗進行過程中，濾紙應平整無折痕，以避免造成實驗Rf值測定出現誤差。

2.顯色后條帶擴散現象。由表2中圖可對比得：在加入顯色劑后，顯色帶仍在緩慢擴散，以致最開始測定組中清晰白色間隔消失。實驗證明，在顯色后一段時間內，繼續擴散現象尤為明顯，常導致測定組的兩條顯色帶融為一條，使實驗結果不明顯，且影響Rf值的測定。

筆者分析，該實驗的顯色劑為茚三酮，在顯色時，加入的茚三酮與水混合，不易揮發，在整個圓形濾紙上均有殘留，但分離后的顯色帶會繼續隨著溶劑的蒸發而擴散，擴散過程中與殘留在濾紙上的茚三酮反應，導致顯色條帶移動擴大。

故，做該紙層析實驗時，選擇的顯色劑應盡量與水不混合且揮發性大，若顯色劑無法滿足上述條件，則應在顯色之后立即測定Rf相關參數，并照相記錄或加入相應穩定劑保存。

3.拖尾現象。由表3可見，對比組存在明顯拖尾現象，而拖尾是紙層析中經常出現的現象。造成拖尾的原因眾多，最主要的原因可能有點樣量過大、展開劑不合適、展開溫度不適、展開濕度不適等。筆者將點樣量對實驗結果的影響做了進一步分析，具體分析如下。

筆者在另一濾紙上滴了不同量的丙氨酸（均是每一滴晾干之后再滴下一滴）。實驗結果如表5。

同理，可計算該補充實驗各顯色帶Rf值。

由上兩表可得，在本次實驗中，丙氨酸用量在1—4滴范圍內（保證每次點樣直徑小于0.5cm），均未出現拖尾現象，同時也通過計算不同用量色斑Rf值可得Rf值與溶劑用量無關。

通過補充實驗，筆者認為，可以排除在點樣1—4滴內，點樣用量對丙氨酸色斑造成拖尾現象的影響，故推測造成丙氨酸拖尾的原因更有可能是點樣直徑過大，或展開劑配比未達要求，展開劑未飽和等，但具體這些因素如何對色斑移動產生影響，以及這些因素對谷氨酸色斑產生的影響是否與丙氨酸相同等問題都有待進一步實驗證明。在這些因素的具體影響未明了的情況下，實驗者點樣時應尤其注意樣點直徑，按照實驗要求配置溶液，并待展開劑飽和展開裝置后再展開。

四、結語

綜上所述，運用以流動液體為固定相的紙層析法分離氨基酸能極大地提高實驗的簡便性，能簡單有效地實現物質分離，但分離過程中應注意細節，如保證濾紙的平整、選取適當顯色劑、顯色之后立刻拍照保存、控制點樣直徑、把握展開劑配比等，以提高實驗的可行性與實驗結果的說服力。

參考文獻：

[1]袁黎明.制備色譜技術及應用（第2版）[M].化學工業出版社，2012.

[2]師治賢，劉梅，楊月琴，胡鳳祖.液相色譜分析進展[J].分析實驗室，2003，22（5）：99-108.

[3]師宇華，費強，于愛民，張寒琦.色譜分析[M].科學出版社，2015.

[4]Christian G D，O Reilly J E.儀器分析[M].王振浦，等，譯.北京大學出版社，1991.

[5]林啟壽.紙上色譜：及其在中草藥成分分析中的應用[M].科學出版社，1982.

[6]田頌九.色譜在藥物分析中的應用（第2版）[M].化學工業出版社，2006.

[7]聶建初，吳國利.生物化學簡明教程[M].2版北京：高等教育出版社，1988：6-8.

[8]云自厚，歐陽律，張曉彤.液相色譜檢測方法（第2版）[M].化學工業出版社，2006.

[9]田明，高崢，蘇英華，楊景芝.氨基酸紙層析實驗的進一步探討[J].實驗室科學，2009，（6）：64-65.

[10]沈同，王鏡巖.生物化學[M].2版.北京：高等教育出版社，1997.