高效液相色譜-串聯質譜法測定糧油中黃曲霉毒素B1

□ 宋寒寒 黃 浩 山東中質華檢測試檢驗有限公司

1 前言

黃曲霉毒素B1（AFB1）對人畜的健康危害極大，所以對它的監控十分必要。目前食品安全國家標準規定食品中AFB1的測定方法依照GB 5009.22-2016，分別有同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法、柱前衍生法、柱后衍生法、薄層色譜法和酶聯免疫吸附篩查法。目前主要應用的是液相色譜法、液相色譜-質譜聯用法等。本課題以糧油為基質研究AFB1的液相色譜-串聯質譜檢測方法，探究不同的條件對實驗結果的影響，旨在簡化前處理步驟、降低成本、提高檢測結果的準確度。

2 實驗部分

2.1 儀器、材料與試劑

Agilent Technologies液相色譜-串聯質譜/質譜儀、湘儀高速冷凍離心機、北京普析純水機、上海精科實業有限公司渦旋振蕩器、Eppendorf單道微量移液器、美國Organomation氮吹儀、Waters固相萃取裝置。

北京康源泰博生物科技有限公司黃曲霉毒素B1免疫親和柱、BONNAAGELA TECHNOLOGIES Cleanert MC。

甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨為色譜純；水為一級水；ANPEL AFB1外標（濃度為1 mg/L，-10 ℃貯存）；Biopure AFB1同位素內標（濃度為0.5 μg/mL，-18 ～ -22 ℃貯存）

2.2 標準溶液的配制及標準曲線的繪制

用乙腈將AFB1標準品配制成濃度為20 μg/kg的使用液，轉移至棕色標品試劑瓶中。用乙腈將AFB1內標配制成濃度為50 μg/kg的使用液，轉移至棕色標品試劑瓶中。以上標品使用液的貯存條件為-18 ℃避光。將0.1%甲酸水溶液與乙腈以1∶9的比例混合，配置成稀釋液，待用。AFB1使用液中加入稀釋液，配制成0.5、1、2、5、10、20 μg/kg的系列標準溶液，其中每個標準溶液都含有0.5 μg/kg的AFB1內標。

2.3 儀器條件與方法設置

2.3.1 色譜條件

流動相A為0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液，流動相B為乙腈；梯度 A 相 為 90%（1～2 min），10%（2～5 min），90%（6～7 min）；流速0.4 mL/min；色譜柱為Agilent C18（2.1×50 mm、1.8μm、1200 bar）；柱溫40 ℃。

2.3.2 質譜條件

母離子的選擇：根據AFB1分子的化學電離性質，結合儀器條件與流動相的選擇，離子化模式選為AJS ESI+。簡化掉色譜柱的保留作用，通過直接進樣法，進行母離子掃描。在一級全掃描狀態下得到準分子離子，調節儀器碎裂電壓（Fragmentor）使母離子豐度達到最大，確定AFB1的母離子質量數。

子離子的選擇與優化：進一步進行子離子掃描，采集碎片離子信息，選擇豐度較大、靈敏度較好且干擾較小的兩對碎片離子作為定性子離子和定量子離子，并對子離子進行優化。設置一個合適的碰撞能量區間（可多次調整），其中能產生最高豐度子離子的數值即為最優電壓，以達到最佳靈敏度。

2.4 樣品前處理

2.4.1 提取

稱取5 g樣品于50 mL離心管中，加入相應標品使用液渦旋振蕩混合后靜置30 min。加入20.0 mL甲酸-水-乙腈溶液（比例為0.1∶15.9∶84），渦旋混勻，在9 000 r/min下離心5 min，取上清液備用。

2.4.2 凈化

準確移取4 mL上清液，加入46 mL 1%吐溫-20的PBS，混勻。將低溫下保存的免疫親和柱恢復至室溫，待原有液體流盡，將樣液移至免疫親和柱上方的注射器筒中，調節至以1 mL/min的速度穩定下滴。樣液過濾完后，再加入2×10 mL水淋洗、抽干。在親和柱下方放置10 mL刻度試管，加入2×2 mL甲醇洗脫，控制1 mL/min的速度下滴。收集全部洗脫液，50 ℃下氮氣吹干，加1.0 mL初始流動相定容，0.2 μm有機濾膜過濾，待進樣。

3 結果與分析

3.1 色譜條件的優化

溶液經由電噴霧霧化，形成微小霧滴，進而電離。因此溶液的成分對AFB1的離子化效率有所影響。本實驗對不同成分的流動相進行對比，結果顯示當乙腈中加入適量的甲酸，創造出酸性環境，離子化效率較高，并且峰形較好、AFB1響應較高（見圖1至圖5）。因此，本實驗選擇0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液與乙腈作為流動相。

圖1 AFB1色譜圖

圖2 AFB1色譜圖（含有甲酸）

圖3 AFB1豐度比

圖4 AFB1豐度比（含有甲酸）

3.2 提取液的優化

AFB1是極性較強的化合物，對于固態樣品，可在研磨后直接使用提取液提取；對于液態樣品，多為油脂類化合物，可采用萃取的方法提取。本實驗使用不同的提取液多次重復試驗，對樣品的加標回收率對比，結果表明以甲酸-水-乙腈溶液（0.1∶15.9∶84）作為提取液時，回收率最高（見表1）。

表1 不同提取液對應的AFB1回收率

圖5 AFB1質譜圖

3.3 提取次數的優化

基質與提取液中的AFB1濃度總是存在一定的平衡關系，隨著提取次數的增加，基質中的AFB1會被更充分的提取出來。通過提取1次、2次、3次、4次、5次的回收率對比，2次提取能明顯的提高回收率，但是再繼續提取，并沒有相對等量的效果提升。結合時間、資源成本等考慮，以2次提取為最佳。

3.4 凈化方式的優化

本實驗對比了免疫親和柱和Cleanert MC兩種凈化方法。免疫親和柱是利用抗原抗體反應原理來進行化合物的篩選，針對性強，不能同時檢測多種真菌毒素。Cleanert MC通用性強，使用方法簡單，對應的實驗室設備非常少。并且無需活化、洗脫、氮吹等步驟，一步過濾實現凈化。兩種方法均能達到85%～100%的回收率，結合操作方法、成本考慮，使用Cleanert MC更佳。

3.5 內標法的優化

本實驗同時采用了內標法和外標法進行分析。在提取基質AFB1的過程中，經過容器、耗材的吸附以及部分溶液殘留，AFB1的微量損失是不可避免的，內標法就是利用內、外標化合物的等比例損失，來消除這種誤差。相比而言，外標法就與前處理及凈化過程有關，操作步驟越簡單、凈化效率越高，則外標法回收率越高。通過加標回收試驗對比，內標法的結果更加準確，外標法成本低、對環境的污染比較小。

4 結論

本文建立了糧油中的AFB1的液相色譜-串聯質譜檢測方法。該方法前處理步驟簡單、條件易于控制、靈敏度高、準確性好、成本低廉，能夠滿足各個地區對AFB1檢測的要求，適用于日常糧油中AFB1的檢測。