可見/近紅外高光譜成像技術對冷藏過程中原料乳細菌總數的無損檢測

□ 趙文靜 內蒙古自治區產品質量檢驗研究院 崔騰飛 陳錦華 寧夏大學農學院

1 引言

在單一食品中，牛乳被稱為為數不多的營養完全食品之一[1-2]。原料乳（生鮮牛奶）含有蛋白質、脂肪、乳糖和各種維生素以及礦物質等一百多種人體需要的營養元素，但也正是因為如此，原料乳中蛋白質等營養物質極易被微生物分解利用，在貯藏過程中生長、繁殖，導致原料乳品質變化。原料乳位于奶業產業鏈的最上游，所以其質量安全將直接影響到乳制品的質量與安全，而原料乳細菌總數是衡量生牛乳原料的重要指標，所以檢測原料乳細菌總數對控制原料乳質量與安全至關重要。

傳統檢測原料乳中細菌總數指標按照GB478.2-2010方法進行的，此檢測方法是基于平板培養和菌落計數，需耗時48 h，且檢測結果也存在著嚴重的滯后性，并且容易導致在原料奶的儲藏和運輸環節造成二次污染，無法滿足原料乳快速、安全等的驗收要求。因此，實時、快速、準確地檢測原料乳中細菌總數對加強原料乳質量控制具有重要的現實意義。現今用于原料乳快速檢測方法有顯微鏡檢測、流式細胞計數法45、還原實驗法光電法、ATP熒光計數法、PCR技術等。各種方法各有優缺點，但沒有一項技術同時具有快速、準確、無需樣品預處理、實時、無損等優點，高光譜成像技術是基于非常多窄波段的影像數據技術，具有非常豐富的吸收譜帶，能夠識別樣品的大量信息，并將圖譜合二為一，是單一的光譜或者圖譜無法比擬的，最大的特點是能夠對幾十個乃至幾百個窄波段以進行連續的光譜覆蓋，而且光譜分辨率高、操作方便等[2-3]，用平均光譜反映樣本，建立原料乳檢測模型、相關性好，能夠滿足方便、快速、無損、準確等檢測原料乳細菌總數的要求。

本文以原料乳為研究對象，利用可見/近紅外高光譜成像技術采集樣品400～1 000 nm的光譜數據，選取正交信號校正法（orthogonal signal correction，OSC）、多元散射校正（Multiple Scattering Correction，MSC）、 卷 積平 滑（Savitzky－ Golay，SG） 3種預處理方法減少噪音干擾，結合PLSR建模方法優選最佳的預處理方法；使用連續投影算法（Successie Projection Algorithm，SPA）、 無 信息消除變量（Uninformative Variable Elimination，UVE）等2種數據降維方法，結合使用偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR） 建模方法分別對全波段和特征波段建模；選取最優模型，為原料乳中細菌總數的快速檢測奠定理論基礎。

2 實驗

2.1 材料與試劑

樣品來源于寧夏銀川市平吉堡牧場乳樣，每份原料乳為100 mL。將獲得的奶罐新鮮乳樣快速置于滅菌取樣瓶中，4 ℃恒溫保溫箱帶回實驗室，編號之后置于冰箱中4 ℃冷藏。每天測試一次（貯藏期1～7 d，共計七次），每次隨機取20個乳樣作為試驗樣本，用于高光譜數據采集和測定細菌總數。

2.2 儀器

實驗過程中使用的儀器主要為：Hyper Spec VIS/NIR 高光譜成像系統（美國Headwall Photonics 公司），如圖1所示。

2.3 高光譜信息采集

為避免圖像采集時環境光的干擾，獲得更加精確的數據，高光譜圖像數據采集前，預先根據光源的照度設定好高光譜攝像頭曝光時間以保證圖像清晰，并調整好輸送裝置的速度以避免圖像空間分辨率失真。采集光譜圖像前需對高光譜進行預熱[3]和參數設定，半小時后應對儀器進行校準[4]。通過多次預實驗確定了最終光譜掃描的參數：物距為400 mm，輸送裝置的步距為180 μm/s，成像光譜儀的曝光時間為35 ms，掃描起始位置90 mm，掃描線實際長度為60 mm。

圖像采集前，為減弱成像光譜儀暗電流和室內照明對圖像的影響，應在暗室進行操作儀器，避免雜散光對采集樣本的干擾。同時需對儀器進行黑白校正[5]，如公式（1）所示。

圖1 VIS/NIR 高光譜成像系統

式（1）中：RO是樣本原始的漫反射光譜圖像，W是白板的漫反射圖像（反射率約100%），D是暗圖像（反射率0%），R是校正后的漫反射光譜圖像。

2.4 細菌總數的測定

2.4.1 測定方法

參照食品安全國家標準GB 4789.2-2010[6]，采用平板計數法對乳中細菌總數進行測定。具體方法如下。

（1）稀釋：取原料乳，充分搖混，使樣品呈均勻狀態。以十倍稀釋法，將原料乳稀釋成10-1、10-2、l0-3、l0-4、10-5系列。

（2） 接種：從最大稀釋度開始，各取l mL l0-3、10-4、10-5的原料乳稀釋液，分別放入已標記好的培養皿內。培養基融化，待冷至45 ℃左右時，在火焰旁倒入培養皿內，細菌總數對應PCA培養基，倒完迅速蓋好，放在桌面上輕輕搖轉，使稀釋的樣品與培養基均勻混合，待平板冷卻固化后，倒置。

（3）培養：于合適的培養溫度下培養一定的時間，對應細菌總數選擇PCA合成培養基，37 ℃培養48小時。

（4） 計數：所有平板在培養到足夠的時間后，選擇每皿出現30～300個菌落的稀釋度為準，計算出每毫升牛奶中含細菌總數。計算公式如下。① 若只有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數范圍內，N每毫升樣品中總活菌數=同一稀釋度兩次重復的菌落平均數×稀釋倍數×10；②若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數范圍內時，按公式（2）計算：N= ∑ C/(n1+0.1n2)d 。

式（2）中：N——樣品中菌落總數；∑C——（含適宜范圍菌落數的平板）；n1——第一稀釋度（低稀釋倍數），n2——第二稀釋度(高稀釋倍數)，d——稀釋因子（第一稀釋度）。

2.4.2 平板計數瓊脂（PCA）

胰蛋白胨5.0 g/L，酵母浸粉2.5 g/L，葡萄糖瓊脂1.0 g/L，瓊脂15.0 g/L,加熱溶解于1 000 mL蒸餾水中，調pH值7.0，分裝三角瓶，121 ℃高壓滅菌15分鐘，備用。取適宜稀釋得樣品液1 mL，加入無菌平皿中心，傾入冷至44～46 ℃的平板計數瓊脂，混勻，待瓊脂凝固后，放置36 ℃培養48小時進行計數菌落。

2.5 圖像處理

利用高光譜成像系統采集樣品圖像后，使用ENVI4.6（ Research System Inc，USA）軟件選取感興趣區域（Region of Interest，ROI），計算出的平均光譜值作為反射光譜。

2.5.1 模型建立

樣本在采集光譜時，由于儀器噪音、暗電流等因素的影響，導致光譜曲線產生不重復和基線漂移等現象[7-8]，本文采用 MSC[9]、SG[10]、OSC[11]三種預處理方法對原始光譜進行處理，多元散射校正（MSC）去除高光譜漫反射光譜中樣品的鏡面反射及不均勻性造成的噪聲，消除漫反射光譜的基線漂移及光譜不重復性，在光譜與濃度線性關系較好和組分性質相似的情況下，MSC校正的效果較好；卷積平滑（SG）盡可能減小平滑對有用信息的影響；SG+MSC兩種預處理方法相結合，可以更好地減少干擾，因此，獲得更多有用信息。光譜預處理后采用偏最小二乘回歸（PLSR）法建立模型。其PLSR方法是一種全新的回歸模型方法，在模型預測研究中應用較為廣泛。PLSR方法結合了多元線性回歸（MLR）與主成分分析（PCR）兩種方法的優勢。在光譜矩陣中，對自變量X相互正交方向上最大方差主成分提取，同時對應變量實測值剪切力Y中光譜矩陣進行冗余信息降維處理，并將Y光譜矩陣引入X矩陣中進行快速分解，同時計算每一個新的主成分數前，將X得分與Y得分進行交換，使得X主成分數與剪切力Y最大程度的直接相關聯，其作用是消除變量多重共線性，也充分利用了光譜數值、吸收值與剪切力之間的線性關系，使得模型預測能力最大程度提高。

2.5.2 模型評判

采用PLSR建立乳中細菌總數預測模型。通過校正集相關系數（Rc）與校正集均方根誤差（rootmean-square error of calibration set，RMSEC）、預測集相關系數（Rp）與預測集均方根誤差（rootmean-square error of prediction set,RMSEP）以及交互驗證均方根誤差（RMSECV）指標進行模型的性能評價。Rc、Rp值越高，其模型相關性越好；RMSEC、RMSECV、RMSEP值 越低，其模型預測能力越好。因此，利用PLSR方法所建立效果較好的模型應具有較高的Rc、Rcv、Rp與較低的RMSEC、RMSECV、RMSEP 值[12]。除此之外，也可以利用Rc+Rp說明模型總體的乳中細菌總數檢測精度[13]。

2.6 數據分析

The Unscrambler X 10.4軟件對光譜預處理，圖像分析軟件為ENVI 4.6，Matlab R2014a軟件進行建模、劃分樣本集，繪圖軟件為origin 8。

3 結果與分析

3.1 篩選最佳預處理方法

本文中采用Galvao等[14]提出的 SPXY（sample set partitioning based on joint x-y distances）法，將剔除異常值的原料乳樣本按3∶1劃分為校正集樣本和驗證集樣本。

表1為原始光譜以及預處理光譜的PLSR建模結果，由相關系數、均方根誤差評價模型穩定性，圖2為原始光譜圖。可以看出使用OSC預處理方法，建模效果降低，因此，經過預處理的光譜建模效果不一定高于原始光譜模型效果；使用其他幾種預處理方法，模型相關系數均高于原始光譜，均方根誤差低于原始光譜，說明這幾種預處理方法可以消除噪音干擾，提高建模效果；經過數據和圖像對比分析，確定SG為最佳預處理方法。

3.2 光譜數據降維

3.2.1 SPA算法選取特征波長

SPA[15]算法可以在很大程度上精簡模型，應用SPA選取特征波長時，設置變量范圍為5-25，歸一化處理后得到前五個波長變量下的RMSECV值，分別為 413、469、525、671、703 nm，特征波長占總波長的4%。

3.3.2 UVE提取特征變量

使用UVE[16]提取原料乳光譜特征波長，運行程序得到輸入變量的穩定性結果，如圖4所示。

圖4豎線左右兩側各為125個變量（左邊為波長變量，右邊為隨機變量）。用此方法共選取了13個特征波長，分別為 416、479、501、503、517、598、634、658、667、692、711、852、981 nm，特征波長占總波長的10.4%。

表1 不同預處理方法的PLSR模型

圖2 原始光譜圖

圖3 SPA提取的特征波長數

圖4 UVE-PLSR穩定性分布曲線

表2 不同波長提取方法建立的PLS模型的結果

3.4 建立模型

對全波段和特征波段分別建立PLSR模型，見表2。整體來看，使用SPA算法提取特征變量數后的建模效果稍高于全波段模型，而UVE建模效果不如全波段建模效果；對比分析3種模型，建模效果最優的是SPA+PLAR，Rc、Rp分別為0.91 95、0.821 4。

4 結論

本文以原料乳為研究對象，采集原料乳400～1 000 nm的光譜圖像，提取反射光譜，同時采用平板計數法對乳中細菌總數進行測定，對光譜值和化學值建立PLSR模型，高光譜成像技術可以實現原料乳中細菌總數預測。主要結論如下。

（1）對原始光譜采用3種方法進行預處理，通過對比分析數據和圖像信息，確定SG為最佳預處理方法，該預處理方法降低了噪音，去掉了無用信息，提高了建模效果，結果：Rc、Rp為0.9190、0.8109。

（2）基于最優預處理方法，使用了2種數據降維方法，提取特征波長數分別為5、13，占到全波段的4%、10.4%。

（3）對以上2種降維處理數據分別建立PLSR模型，SPA+PLAR為最優模型，Rc、Rp分別為0.919 5、0.821 4，提取特征波長可減少冗長數據，降低維數，實現快速檢測。