SPE-HPLC法測定桑椹中的反式白藜蘆醇及其糖苷

□ 舒友琴 楊新玲 河南牧業經濟學院食品與生物工程學院

白藜蘆醇，化學名稱為芪三酚,分子式為C14H12O3。研究發現，白藜蘆醇具有抗腫瘤、抗凝血、抗高血脂癥及防治骨質疏松等多種生物活性[2]。含白藜蘆醇的天然植物有葡萄、花生、桑椹、虎杖等。在自然條件下，白藜蘆醇還能以白藜蘆醇苷的形式存在，糖苷具有和白藜蘆醇同樣的生物活性。白藜蘆醇及其苷存在反式和順式兩種構型, 反式異構體的生物活性高于順式異構體。

目前，白藜蘆醇的測定方法主要有HPLC法[3]薄層熒光掃描法[4]，測定對象多集中于葡萄、葡萄酒、虎杖等樣品。本文采用固相萃取預處理樣品，用高效液相色譜法測定了桑椹中的反式白藜蘆醇及其糖苷的含量。方法簡便、快速、靈敏、準確。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

超高效液相色譜儀（美國waters公司）、C18固相萃取柱（博納艾杰爾科技有限公司，500 mg，6 mL）、真空冷凍干燥機（妙生科技有限公司）、紫外-可見分光光度計（北京萊伯泰科儀器股份有限公司）。

白藜蘆醇及其苷標準品（反式，純度99%，中國食品藥品檢定研究院），甲醇（色譜純，Dikma分裝），其他試劑均為分析純。桑椹鮮果（紫果）購于農貿市場，用塑料袋密封后，置4 ℃冰箱中保存。

1.2 標準溶液的制備

分別準確稱取適量反式白藜蘆醇和反式白藜蘆醇苷標準品，以甲醇為溶劑，分別制成濃度為0.1 mg/mL的標準溶液。置4 ℃冰箱中避光保存備用。

1.3 色譜條件

色譜柱為Hypersil C18（4.6 mm×150 mm，5 mm），流動相為甲醇-水，梯度洗脫（20 min內由20%甲醇溶液變為50%甲醇溶液，20～30 min內由50%甲醇溶液變為100%甲醇）。流速0.8 mL/min，檢測波長304 nm，柱溫40 ℃，進樣量為10 mL。

1.4 樣品處理

選成熟的新鮮桑果200 g，先用水浸泡20 min，沖洗干凈后，再用0.03%高錳酸鉀溶液浸泡殺菌5 min，取出，清水沖凈、晾干。

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將樣品放入-18 ℃冰箱中預冷凍72 h后，轉移至真空冷凍干燥箱中，先維持板溫在-25 ℃，樣品溫度在-23 ℃下干燥48 h，再維持板溫在10 ℃，樣品溫度在0 ℃下干燥4 h。

將干燥后的桑葚研碎。準確稱取粉末5 g，用甲醇索氏抽提8 h后，將提取液用旋轉蒸發儀蒸干，殘留物用5.00 mL甲醇溶解。

將5.00 mL甲醇溶解液以約0.4 mL/min的速度通過已活化好的固相柱，以淋洗液淋洗，抽真空除去柱中水分后，以5.00 mL甲醇洗脫,洗脫液即為測試液。測試液經0.45 μm濾膜過濾后進行HPLC測定。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

由二組分的紫外掃描圖譜可知，反式白藜蘆醇與其糖苷的最大吸收波長分別為306 nm和302 nm。綜合二者的情況，測定時采用的紫外檢測波長為304 nm。

2.2 固相萃取條件的優化

2.2.1 柱活化

固相柱使用前必須進行活化處理。通過活化，不僅可以去除柱中可能存在的雜質，形成合適的溶劑環境，并且可以提高萃取的重現性。根據柱材料特性、樣品組成及所選用的洗脫劑，本文選用10 mL去離子水和10 mL甲醇各活化一次。

2.2.2 加樣體積和上樣速度的確定

根據固相萃取的要求，上樣質量不超過柱中填料量的5%，故實驗中上樣量應不超過25 mg。據文獻報道，干桑葚中的花青素含量約為1 936 mg/kg，經計算，稱樣量不超過13 g。考慮到桑葚中除花青素外，還含有其他競爭性組分。故本實驗中桑葚粉的稱樣量為5 g。

進樣速度會影響萃取回收率。進樣太快，目標組分未來得及被吸附即流出萃取柱，降低了萃取回收率，但進樣太慢，會延長過柱時間。根據試驗結果，本文采用的進樣速度為0.4 mL/min左右。

2.2.3 干擾物的淋洗

桑葚中含有大量的花青素、黃酮類及其他水溶性物質，它們會干擾白藜蘆醇的測定。根據這些物質能溶解于極性溶劑的特性，本文首先采用10 mL去離子水淋洗以去除大部分色素，再用10 mL pH=8.0（用K2HPO4和KH2PO4溶液調節）的12%乙醇淋洗。

2.2.4 柱干燥時間的確定

淋洗之后，柱中會殘留大量水分，從而影響洗脫劑對測定組分的溶解能力，影響洗脫效果，故洗脫前要對固相柱進行干燥。本試驗采用在真空下對固相柱抽干20 min。

2.2.5 洗脫劑及其用量的確定

白藜蘆醇易溶于甲醇、乙醇和乙酸乙酯等有機溶劑中。考慮到柱活化及HPLC測定時所用的流動相均涉及甲醇，本實驗采用甲醇為洗脫劑。

文獻報道的洗脫劑用量差別較大。實驗發現，以5.00 mL甲醇洗脫，由紫外分光光度法測得反式白藜蘆醇及其苷的萃取回收率分別為98.6%和99.7%。

2.3 工作曲線及方法檢測限

吸取適量反式白藜蘆醇及其糖苷標準溶液，分別制備含二組分0.5、2.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL的混合標準系列，按色譜條件測定，以峰面積Y對相應的組分濃度X（μg/mL）進行線性回歸，根據信噪比S/N=3計算檢測限。結果見表1。

2.4 方法的回收率和精密度

準確稱取5 g同一桑葚粉末三份，分別加入反式白藜蘆醇及其糖苷各30μg、40μg和50μg, 按實驗方法，每個樣液平行測定5次。測得其平均回收率分別為98.2%和101.8%，平均精密度分別均為2.3 %和2.4 %。

2.5 樣品測定

準確稱取桑葚粉末5 g, 按實驗方法測定，以保留時間定性，以外標法定量。根據干物質占鮮桑果總重的百分率，換算成鮮桑果中白藜蘆醇及其苷的含量。圖1為色譜圖，表2為鮮桑椹樣品測定結果。

綜合文獻報道，不同品種桑葚中含白藜蘆醇的總量不同，大多在7.8～23.6μg/g。由表2可知，三個桑葚樣品中白藜蘆醇的總量變化不大，總量在8.69～8.94 μg/g。這是因為三個樣品購自同一農貿市場，均為成熟的紫桑葚果，這些桑果很可能來自于同一品種的桑樹。

表1 標準曲線和方法檢測限

圖1 標準溶液和桑椹樣液的色譜圖注：1.標準混合溶液；2.桑椹樣液a.反式白藜蘆醇苷；b.反式白藜蘆醇

表2 桑椹中的白藜蘆醇及其糖苷的含量（n=3）

4 結論

本文建立了SPE-HPLC法測定桑椹中反式白藜蘆醇及其糖苷的方法。桑葚提取液經固相萃取去除干擾成分后，以HPLC法測定。方法快速、簡便、靈敏、準確，還可用于其他樣品中白藜蘆醇及其苷的測定。