非梗阻性無精子癥基因多態性分析研究*

周敬華 韓瑞鈺 默 義 劉東科 王樹松

河北省計劃生育科學技術研究院（國家衛計委計劃生育與優生重點實驗室）（河北石家莊 050071）

非梗阻性無精子癥（non-obstructive azoospermia,NOA）是男性不育的重要原因之一。近年來，遺傳因素在無精子癥發病中的影響越來越受到人們的重視。目前已陸續發現了一系列原發性無精子癥相關基因，提示了相應的人類同源基因極有可能與男性NOA顯著相關。單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism, SNP）是人類基因組序列中最常見的一種變異形式，使造成不同個體罹患疾病的風險不同。因此，通過分子生物學手段發現NOA相關的潛在風險遺傳因素，進一步揭示相關基因多態性與NOA的密切關系，可闡述疾病的致病機制。本研究采用實時熒光定量Taqman-MGB探針法對NOA患者進行了8個多態性基因位點的分布研究，以期為無精子癥相關易感基因或其有效分子標記提供參考。

資料與方法

一、研究對象

本研究的研究方案通過河北省計劃生育科學技術研究院醫學倫理委員會。選自于2016年1月至2017年4月在本院就診的NOA病例作為研究組，并且排除梗阻性無精子癥、染色體異常、隱睪、病毒性睪丸炎、精索靜脈曲張、垂體疾病以及全身性疾病等引起的繼發性不育。NOA患者的診斷基于標準的臨床檢查程序， 包括病史、體格檢查、精液分析 （3次檢查精子濃度為零）、血清生殖激素分析、超聲評價和遺傳學檢測（包括核型分析、Y 染色體微缺失檢測等）。為了避免樣本選擇偏差，任何 NOA 患者含有核型異常、遺傳學異常或 Y 染色體微缺失，均被排除。對照組選用有正常生育史的健康男性，年齡20～45歲。研究組和對照組均被告知研究目的、方法和意義，并簽署知情同意書。

二、材料與試劑

離心柱型血液基因組DNA提取試劑盒（DP348-02，北京天根生化科技有限公司）；TaqMan SNP基因分型試劑盒包括：2×TaqMan Universal PCR Master Mix（ABI 公司），40×SNP Genotyping Assay Mix（ABI 公司）。DNA 的濃度和純度檢測采用Nanodrop 2000 超微量分光光度計（美國 Thermo Scientific公司）將濃度和純度滿足要求的DNA溶液（OD260／OD280值1.6～2.0、質量濃度1～20ng）保存于-80℃超低溫冰箱中備用。

三、全血基因組DNA的提取

采集2mL外周靜脈血于EDTA抗凝管中，放置于-20℃冰箱保存備用。全血基因組DNA提取按照試劑盒說明書進行，并用TE溶解。

四、檢測基因多態性

候選 SNPs 位點具體基本信息見表1。PCR終反應體系（10μL）見表2。在ABI 7500型Fast Realtime PCR儀中進行DNA擴增反應。PCR反應條件如下：60℃，1min（預加熱）→95℃，10min（預變性）→95℃，15s（變性）→60℃，1min（收集熒光），變性、收集熒光進行40個循環，最后在60℃收集熒光1min。為保證實驗結果的準確性，每次加樣設置一個陰性對照（NTC），加樣品的過程中需嚴格避光，以免探針及相關試劑降解失效。反應完成后， 在 ABI 7500 型熒光定量 PCR 儀上讀取樣品孔中的終點熒光，利用TaqMan Genotyper Software Version 1.0.1分析軟件確定各個樣本的基因分型結果。

表1 TaqMan?-MGB 探針基本信息表

表2 TaqMan?-MGB 探針法RT-PCR 反應體系

五、基因型分析

本實驗根據ABI公司試劑盒信息，對多態性位點分型時設定等位基因對應FAM熒光為Y軸，VIC熒光為X軸，基因型分型采用雙驗證的方法，即散點圖+擴增曲線兩方面驗證，以確保基因分型準確無誤。

六、統計學分析

利用SPSS 19.0進行統計學分析，SNP多態性位點在兩組間的分布差異利用Chi-square檢驗和Fisher exact檢測。 此外，比值比（OR）及95%可信區間（95% CI）利用非條件Logistic回歸模型計算。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、研究對象

1 9 2例N O A患者作為研究組，平均年齡（30.08±5.38）歲；124例正常健康男性作為對照組，平均年齡（32.05±5.97）歲。兩組間年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

二、基因型頻率與NOA易感性之間的關系

研究組與對照組中TEX15基因rs323346位點各基因型分別為TT 85.42% vs76.61，CT 13.54%vs 21.39%，CC1.04% vs 0%，兩組基因型構成比具有統計學差異（P＜0.05）。與TT基因型相比，攜帶CC基因型的個體患NOA的風險是其1.745倍，攜帶CC+CT基因型的個體患NOA的風險較攜帶TT型的個體低（P＜0.05，OR=0.559，95%CI=0.314～0.996）。其余多態性位點在兩組中各基因型的分布沒有統計學意義。8個SNP多態性位點基因型頻率的分布及其與研究組易感的相關性結果見表3。

表3 多態性位點基因型頻率與NOA易感性之間的關系

三、等位基因頻率與NOA易感性之間的關系

經統計學分析，結果顯示所測 8個位點等位基因頻率分布在研究組和對照組中比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表4。

表4 多態性位點等位基因頻率與NOA易感性之間的關系

討 論

無精子癥可分為梗阻性無精子癥和NOA。梗阻性無精子癥主要原因包括先天性發育異常、精索靜脈曲張和生殖道感染等, 其約占無精子癥患者的 40%[1]。遺傳因素是導致NOA發生的主要原因，如染色體核型異常、Y染色體微缺失[2]、基因突變與缺失以及基因的單核苷酸多態性等[3,4]。一些遺傳學研究通過現代核酸測序技術和大規模的基因探針，發現導致 NOA 疾病新的易感基因。但是，仍然有超過 50% 的無精子癥的致病因素不可知[5]。近年來，人們一直在尋找與精子發生和生精障礙相關的基因突變、缺失或單核苷酸多態性[6]以期能更好地闡述疾病的致病機制。已證實，特定基因的單核苷酸多態性改變與臨床上的原發性無精子癥存在關聯[7-9]。

TEX15 （testis-expressed 15）基因定位于人類染色體8號染色體上，僅僅在睪丸和卵巢中表達[10]，TEX15 轉錄物存在于精原細胞和初級精母細胞中，在調控DNA 斷裂雙鏈上染色體聯會、DNA 雙鏈修復和減數分裂重組過程中起著重要的作用。對歐洲人群研究顯示 TEX15 基因 rs323344 和 rs323345 多態性在NOA、嚴重少精子癥、中度少精子癥患者與正常生育對照人群存在著差異[11]，而Ruan等[12]則認為rs323346顯著增加了罹患嚴重少精子癥的風險,但未發現與無精子癥患病的風險顯著相關。我們的結果顯示在NOA組中與對照組中TEX15基因rs323346位點各基因型分布具有統計學差異（P＜0.05）。與TT基因型相比，攜帶CC基因型的個體患NOA的風險是其1.745倍，攜帶CC+CT基因型的個體患NOA的風險較攜帶TT型的個體低（P＜0.05，OR=0.559，95%CI=0.314-0.996）。而rs6980502位點基因型頻率以及等位基因頻率則沒有明顯差異。

GPRC6A為G蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptor, family C, group 6, type A, GPRC6A）位于6q22.31，在腦、骨骼肌、睪丸和白細胞高表達[13,14]。有研究[15]認為GPRC6A基因rs2274911多態性被證實與睪丸損傷有關，rs6901250組成的單體型頻率在前列腺癌患者明顯升高。SP011基因定位于20q13.2-13.3，系減數分裂相關基因，所編碼的蛋白質在減數分裂染色體斷裂重組中發揮著重要的作用，已有研究表明SP011基因可能是一個不育易感基因[16]。馮戰啟等[17]研究發現SP011基因rs28368082位點是原發性不育患者的遺傳易感因素。RNF8 基因位于人類染色體 6p21.2上，是一種組蛋白泛素化的 E3 連接酶。在精子形成階段，包裹精子 DNA 的組蛋白由組蛋白類似的魚精蛋白代替，而這種轉變由 RNF8 依賴性組蛋白泛素化所引起的[18,19]。RNF8基因rs104669等位基因頻率在NOA患者組和對照組間顯示有顯著性差異，可以增加罹患 NOA 風險[20]。睪丸特異性含溴結構域的蛋白（testis-specific bromodomain-containing protein,BRDT）是BET蛋白家族的成員，在精子發生過程的核染色質重組中起關鍵作用[21]。對不育男性全基因組分析表明 BRDT 的單核苷酸多態性與歐洲男子的少精子癥和無精子癥相關[22]。卵丘細胞中的 STAG3是參與卵母細胞第一次減數分裂的一種調節蛋白，而Llano等[23]最新發現STAG3是人類男性不育一個強有力的候選基因。我們的結果顯示GPRC6A基因rs2274911, rs6901250；SPO11 基因rs28368082；RNF8基因rs104669；BRDT基因rs3088232和STAG3基因rs1637001位點基因型頻率和等位基因頻率在NOA組和對照組中差異均無統計學意義。

造成研究結果有差異的原因可能是基因多態性與精子發生障礙易感性在不同種族或地域人群中存在的機制目前尚不清楚，并且已有大量報道表明，種族因素、不同的地理及環境條件，可能會造成遺傳學基礎的差別，進而導致在精子發生障礙患者中存在不同的發病機制。因此，推測本研究結果與上述研究的結果不同可能是由于研究人群的遺傳學背景或者地理區域不同有關。另外，由于受樣本量限制，要使結果更具有說服力，需要擴大樣本量進一步驗證基因多態性與NOA的關系。

目前，研究基因多態性的方法逐漸增多,但許多方法由于其自身方法學特點存在著各自的優缺點，比如PCR-限制性片段長度多態性、等位基因特異性PCR，這些方法由于均需先經過PCR擴增，擴增產物再經瓊脂糖凝膠電泳后才能區分基因型，雖然過程操作不復雜，實驗成本也偏低，但其在靈敏度方面和操作時間上都處于劣勢，且實驗過程易受污染，結果出現假陽性或假陰性。相比之下，基因堿基序列測序則顯得較為精確和可靠，但它需DNA測序儀等昂貴儀器，并且對測序標本要求嚴格，而Taqman-MGB法則利用MGB探針標記不同基因型的探針，整個實驗過程在實時熒光定量 PCR儀中完成，無需電泳等后處理，在特異性和靈敏度上也優于其他[24]。

本文首次應用Taqman-MGB法檢測了SPO11 基因rs28368082，TEX15基因rs323346，rs6980502；STAG3基因rs1637001；GPRC6A基因rs2274911，rs6901250；RNF8基因rs104669；BRDT基因rs3088232位點，共8個多態性基因位點的分布頻率。結果顯示TEX15基因rs323346多態性位點與NOA發病風險存在關聯，可能是NOA的遺傳易感基因之一。