精子鞭毛缺陷導致弱精子癥的研究進展

余 怡 王家雄 綜述 楊慎敏 審校

南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院生殖遺傳中心（江蘇蘇州 215002）

全世界目前約有8%～15%的夫婦婚后一年不育，其中男性因素導致的不育占到所有病例的50%。另外，弱精子癥也是導致男性不育的一個重要因素，弱精子癥的精子總數(shù)和濃度正常，但前向運動精子＜32%或精子總活力＜40%[1]。

部分弱精子癥與精子尾部特異性的超微結構異常有關，如原發(fā)性纖毛運動障礙（primary ciliary dyskinesia, PCD）、精子鞭毛多發(fā)形態(tài)異常（multiple morphological abnormalities of the sperm flagella,MMAF）和常染色體顯性多囊腎?。╝utosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD）等，它們與弱精子癥的關系越來越受到學者的關注。臨床上，與遺傳缺陷有關的弱精子癥采取經(jīng)驗性治療往往收效甚微。光鏡下的精子形態(tài)學分析和透射電鏡觀察能夠甄別由于精子鞭毛畸形導致的精子運動障礙，為診斷和治療提供重要依據(jù)。而該類患者的生育結局也是目前關注的重點。

一、弱精子癥的部分病因

（一）精子鞭毛的超微結構概述

精子尾部又稱鞭毛，長徑約55μm，超微結構分4個部分：頸、中、主、末段。各段組成由內(nèi)向外一般為軸絲、外周致密纖維、線粒體鞘和細胞膜。正常精子軸絲由中央兩根單獨的微管與周邊9對雙聯(lián)微管組成，稱9+2結構。動力蛋白臂存在著ATP酶，為A管與B管的滑動提供能量，帶動鞭毛的運動。線粒體鞘螺旋盤繞在精子中段，參與能量代謝。這些結構中，主段最長，約50μm，但該段不含線粒體鞘。主段外周致密纖維周圍有纖維鞘包繞，內(nèi)有糖酵解酶，與精子能量的產(chǎn)生有關[2,3]。具體結構示意如圖1。

圖1 正常精子鞭毛橫截面結構示意圖[3]

（二）纖毛/鞭毛缺陷導致的弱精子癥

1. 原發(fā)性纖毛運動障礙（PCD）：哺乳動物的纖毛種類包括初級纖毛與運動纖毛兩大類，纖毛主要由纖毛膜、基質(zhì)、軸絲三部分組成，當動力蛋白臂不能參與纖毛與鞭毛軸絲的組裝時即引起PCD[2]。PCD主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀，如慢性中耳炎、鼻竇炎、支氣管擴張和肺部感染等，內(nèi)臟反位（Kartagener綜合征）、腦積水等，部分男性因精子受累而導致弱精子癥和不育[4]。PCD患者呼吸道纖毛透射電鏡下的超微改變主要為外側(cè)動力蛋白臂或內(nèi)側(cè)動力蛋白臂缺陷等，少數(shù)患者纖毛超微結構未發(fā)現(xiàn)異常[4]。PCD的超微結構缺陷除動力蛋白臂外，還包括中心復合體（central complex，CC）的結構缺陷[5]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過30個基因與PCD的發(fā)生有關，其編碼的蛋白主要影響纖毛動力蛋白臂、軸絲、內(nèi)部細胞骨架的組裝[5]。由于運動纖毛和精子鞭毛具有共同的軸絲結構，大多數(shù)PCD的男性同時存在不育癥[6]。法國的一項多中心多樣本研究發(fā)現(xiàn)，其統(tǒng)計的49例PCD男性患者中有37例同時伴有不育，不育男性中精子鞭毛超微結構的改變又以內(nèi)側(cè)動力蛋白臂缺陷與微管結構紊亂最常見，達到43.2%（16/37），其次為內(nèi)側(cè)、外側(cè)動力蛋白臂結構缺陷共存，比例為24.3%（9/37）[7]。PCD導致的嚴重弱精子癥或100%不活動精子，其精子鞭毛的光鏡下形態(tài)大致正常，超微結構可見動力蛋白臂缺損[8]，但并非所有PCD患者都存在精子鞭毛超微結構異常，部分PCD伴不育的患者透射電鏡觀察正常[8,9]。

越來越多的PCD致病基因突變被鑒定出，相關蛋白定位于軸絲微管的放射輻頭部、動力蛋白臂、中央微管等結構中，基因突變最終導致相關結構組裝異常，纖毛/鞭毛運動功能喪失或嚴重受損[10]。Olcese等[11]研究發(fā)現(xiàn)PIH1D3的點突變，是導致早期軸絲動力蛋白臂組裝中斷的原因之一，P1H1D3蛋白的缺失會影響內(nèi)側(cè)動力蛋白臂相關結構的組裝，從而引起PCD。部分DNAH11基因突變個體的纖毛超微結構在透射電鏡下可表現(xiàn)為正常， Shoemark等[12]通過電子斷層掃描發(fā)現(xiàn)，攜帶DNAH11突變基因的患者的近側(cè)的外側(cè)動力蛋白臂體積要比正常對照組小，提示DNAH11基因主要影響外側(cè)動力蛋白臂的組裝。EL等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，并非所有的PCD患者均存在纖毛動力蛋白臂的結構缺損，其樣本研究發(fā)現(xiàn)約有15%的PCD患者動力蛋白臂正常，而表現(xiàn)為中心復合體的結構異常，對其中一位患者測序發(fā)現(xiàn)了DNAJB13基因突變，該基因編碼熱休克蛋白40（heat shock protein40,HSP40），其同源蛋白在鞭毛蟲體內(nèi)定位于放射輻。體外實驗發(fā)現(xiàn)，該基因突變后，熱休克蛋白40家族的保守區(qū)域的殘端蛋白穩(wěn)定性下降，同時還誘發(fā)了溶酶體的降解，這一結果解釋了該患者精子鞭毛動力蛋白臂正常而CC異常的現(xiàn)象。Vanaken等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，在其研究的PCD伴隨不育的病例中，CCDC39、CCDC40基因突變所致的不育比例最高，約為43.2%（16/37），其主要影響內(nèi)側(cè)動力蛋白臂與微管結構的組裝，引起鞭毛活力下降，其余的致病基因包括LLRC6、DNAH11、DNAI1等，其中DNAH11突變的精子鞭毛在透射電鏡下并未觀察到超微結構的改變。后期Tang等[14]在中國MMAF患者中鑒定出了CCDC39突變，提示CCDC39基因在PCD與MMAF的致病中可能有共同的機制。

2. 精子鞭毛多發(fā)形態(tài)異常（MMAF）：精子鞭毛多發(fā)形態(tài)異常，也稱作精子纖維鞘發(fā)育不良。MMAF患者的精液體積和pH值大都在正常范圍，但出現(xiàn)嚴重的精子鞭毛畸形和精子運動障礙。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[15]，患者光鏡下正常尾部精子僅占0.5%～20.5%，異常尾部表現(xiàn)包括無尾、短尾，尾 部卷曲、彎折、粗細不規(guī)則等，其中以短尾最多見，約占40.5%～52%，前向運動精子率0%～3.6%。

透射電鏡觀察可進一步發(fā)現(xiàn)MMAF病變精子超微結構，中心微管缺失是MMAF的特征性表現(xiàn)之一，伴隨線粒體鞘缺陷、纖維鞘增厚及動力蛋白臂缺失[15-17]。對MMAF的致病基因的研究近年來得益于測序技術而進展[18]。本課題組通過全外顯子組測序的方法鑒定出中國MMAF患者的致病基因DNAH1、CCDC39、CFAP43、CFAP44和CFAP65[14]。其中DNAH1是最為常見的致病基因。DNAH1基因影響精子鞭毛的內(nèi)側(cè)動力蛋白臂結構，DNAH1敲除后的純合小鼠表現(xiàn)為精子活動力下降、內(nèi)側(cè)動力蛋白臂缺失，而外側(cè)動力蛋白臂存在，這與人類DNAH1突變的表型一致[19]。CFAP43和CFAP44等位基因敲除小鼠精子鞭毛表現(xiàn)為短尾、卷曲、缺失，與人類MMAF類似[14,16]，Coutton等[16]的進一步研究發(fā)現(xiàn)，CFAP43和CFAP44基因主要影響Dnah5、Dnali1、Rsph1、Rsph4、Gas8、Spef2的蛋白合成，而這些蛋白分別是動力蛋白臂、放射輻、nexin鏈接的組成部分，這為CFAP43和CFAP44基因缺失導致的分子學水平缺陷提供了證據(jù)。該課題組還使用布氏錐蟲這一模式生物驗證了CFAP43、CFAP44蛋白的定位與功能，兩者共同定位于PFR（para flagellar rod），該結構類似與哺乳動鞭毛的外周致密蛋白與纖維鞘，連接著雙聯(lián)微管，在鞭毛的運動中起到重要作用[16,20]。CEP135也是中國MMAF的致病基因[21]。Akap4、Tekt3、Tekt4和Cabyr的突變導致小鼠鞭毛的結構缺陷，CatSper1、Pgk2、Gapdhs和Ldhc突變會導致鞭毛的運動功能缺陷[21,22]。SPEF2基因影響精子尾部附屬器官如軸絲、外周致密蛋白、線粒體鞘等的正常合成與組裝，精子的活力進而受到影響[23,24]。Lorès等[25]的近期研究發(fā)現(xiàn)L673P錯義突變會引發(fā)MMAF與男性不育，暫未發(fā)現(xiàn)其能導致PCD。

3. 常染色體顯性多囊腎病（ADPKD）：常染色體顯性多囊腎病是一種遺傳疾病，雙側(cè)腎臟出現(xiàn)廣泛的囊性改變，其發(fā)病多出現(xiàn)在成年時期的40歲以后，臨床表現(xiàn)為血尿、腎結石、尿路感染、夜尿增多等，疾病的進展往往導致嚴重的腎功能損傷，發(fā)病率約千分之一，其腎臟外表現(xiàn)可累及男性生殖器官，包括睪丸、附睪、精囊和前列腺的囊腫[26]。男性不育患者中伴有ADPKD的病例已被廣泛報道[27]，但ADPKD導致男性不育的具體機制尚未完全明確，而不僅僅是因為精子超微結構缺陷（動力蛋白臂結構缺陷、微管結構缺失或排列紊亂等）。其產(chǎn)生的機制可能包括：異常的多囊蛋白可能會對精液產(chǎn)生異常，ADPKD患者伴發(fā)精囊腺囊腫引起梗阻性少精或無精子癥，ADPKD患者發(fā)生終末期腎病時導致不育，ADPKD患者精子鞭毛軸絲缺乏中心微管、多胱氨酸缺陷、PKD基因突變和AZF基因微缺失[28-31]。腎臟上皮細胞初級纖毛上有多囊蛋白（polycystin-1、2，PC-1、2）的存在，兩者形成受體通道復合物,參與上皮細胞增殖分化的信號調(diào)控有關，動物實驗發(fā)現(xiàn)，編碼兩種蛋白的PKD基因突變后，腎小管上皮細胞出現(xiàn)了過度增殖、管腔增大的多囊腎病理表現(xiàn)。進一步遺傳研究發(fā)現(xiàn)，多囊蛋白調(diào)節(jié)未知的纖毛信號通路（cilia-dependent cyst activation, CDCA），該信號通常是腎單位結構穩(wěn)態(tài)維持的一部分，ADPKD發(fā)生是由于完整纖毛缺乏多囊蛋白而失調(diào)時發(fā)生的，此時CDCA能夠驅(qū)動囊腫的生長[32]，而該通路是否在維持精子鞭毛超微結構穩(wěn)定中起作用目前依然未知。

A D P K D的發(fā)生主要與多囊腎致病基因（polycystic kidney disease gene 1、2，PKD1、2,）有關。GANAB基因，其主要編碼葡萄糖苷酶II亞基α（GIIα）對PC-1和PC-2的成熟和表面的纖毛定位是絕對需要的，GANAB基因敲除細胞中可見成熟PC-1減少，因此GANAB是ADPKD候選基因的一個重要補充[33]。

二、精子鞭毛缺陷所致弱精子癥的輔助生殖治療

卵胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）是鞭毛缺陷所致弱精子癥的有效助孕手段[30,34]。對于射精中100%無活動精子的情況，低滲腫脹試驗、精子鞭毛靈活性測試、激光輔助篩選等技術可以挑選出活精子，采取睪丸精子也不失為一種有效方式[35,36]。PCD伴有不育的患者可通過輔助生殖技術使妻子成功妊娠，妊娠成功率可達到40.5%（15/37）[7]。MMAF患者可以通過ICSI使妻子成功妊娠[37,38]，本中心MMAF患者ICSI受精率為51.5%（34/66），短期觀察后代未見異常[38]。伴有ADPKD的嚴重弱精子癥患者行ICSI治療成功受孕的病例早在上世紀九十年代已有報道[30]，蘇煌等[34]報道的伴有ADPKD的嚴重弱精子癥患者行ICSI治療結局回顧性分析結果顯示15例患者行28個ICSI周期后有10例取得了臨床妊娠，但單周期妊娠成功率較低，且子代可能面臨一定的遺傳學風險，采取胚胎植入前遺傳學診斷可以最大程度地降低后代患病的幾率，目前已有成功案例報道[39]。

三、展望

對于嚴重的男性不育，往往存在明確的病理因素，需要仔細了解患者病史，并通過適當?shù)妮o助檢查明確病因。PCD、MMAF和存在精子鞭毛結構缺陷的ADPKD，用非特異性治療往往無效，而這些疾病與男性不育的關系以及其在男性不育中的機制依然沒有得到深入研究。目前大多認為PCD、MMAF、ADPKD的共同病理機制為纖毛/鞭毛結構異常，但這三者在弱精子癥的致病過程中的是否存在交叉因素依然未知。且當今對這三種疾病導致弱精子癥的研究多局限于纖毛/鞭毛形態(tài)結構與遺傳學分析，因此亟需更多研究從精子發(fā)生的角度去評判疾病發(fā)生的分子機制。日益更新的分子生物學技術將逐步揭示這些疾病發(fā)病的分子學機制，同時為選擇合適的治療方式提供理論依據(jù)。PCD、MMAF和存在精子鞭毛結構缺陷的多囊腎的弱精子癥患者，通常選擇ICSI得到受孕，但術前的遺傳咨詢尤為重要，子代的健康狀況需要更多隨訪。