激肽系統(tǒng)在ED大鼠模型陰莖組織中的表達(dá)變化研究*

王天宇 斯依提·阿木提 馬文靜 劉文娟 張盼盼 阿地力江·伊明**

1. 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室（烏魯木齊 830011）; 2. 新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室

勃起功能障礙（ectile dysfunction，ED）是指陰莖持續(xù)不能達(dá)到或維持足夠的勃起以完成滿(mǎn)意的性生活，是影響男性健康的常見(jiàn)疾病之一，其發(fā)生的直接原因是陰莖海綿體平滑肌不能充分舒張，導(dǎo)致海綿體靜脈竇不能充分開(kāi)放、充盈[1]。前期工作中，我們?cè)趯?duì)ED大鼠模型陰莖的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)T-激肽原顯著上調(diào)，可作為蛋白候選標(biāo)志物，但其作用機(jī)制不詳。本研究是在此基礎(chǔ)上，對(duì)ED大鼠陰莖組織中激肽系統(tǒng)的表達(dá)改變進(jìn)行進(jìn)一步研究，探討ED發(fā)生發(fā)展與激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)表達(dá)變化的關(guān)系，及藥物伊木薩克片可能的調(diào)控作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

正常雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量（200±10）g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

二、主要實(shí)驗(yàn)儀器

RXZ-436LD型人工氣候箱（寧波江南儀器廠(chǎng)），BS-1105 型電子天平（北京賽多科斯天平有限公司），Eppendorf PCR儀（德國(guó)Eppendorf公司）5810R型低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），DYY-8C電泳儀（方正公司），微波爐（HEGON公司），GL-88B漩渦混合器（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司），低溫試劑柜（中科美菱），UVP凝膠成像儀（美國(guó)UVP公司），水平脫色搖床（金壇市成輝儀器廠(chǎng)），Proteinsimple Fluor Chem E 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Proteinsimple公司）。

三、主要試劑和藥物

阿樸嗎啡（Apomorphine,APO，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：SLBP2431V），伊木薩克片（新疆和田維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司），miRneasy MiNi Kit試劑盒（德國(guó)QIAGEN公司，批號(hào)：154027952），M5 First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（北京聚合美公司，批號(hào)：20170308），2×Taq PCR Mastermix 試劑盒（北京天根生化有限公司，批號(hào)：Q5116），EB（北京天根生化有限公司），激肽釋放酶1兔多克隆抗體（Abcam公司），T-激肽原1鼠單克隆抗體（Cloud-Clone Corp 公司）， BCA蛋白定量試劑盒（北京聚合美公司），羊多克隆抗兔二抗（北京中杉金橋），羊多克隆抗鼠二抗（北京中杉金橋），DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋公司），免疫組化檢測(cè)試劑盒（北京中杉金橋公司）。

四、動(dòng)物模型的建立與藥物干預(yù)

具有正常性功能的雄性SD大鼠120只，分為正常對(duì)照組20只（N組），余100只為造模組（M組），采用環(huán)境雌激素樣飲食聯(lián)合冷應(yīng)激建立ED模型[2]。22周后，經(jīng)性行為學(xué)實(shí)驗(yàn)和APO陰莖勃起實(shí)驗(yàn)篩選出ED模型組（ED組，56只），未成ED大鼠為復(fù)合應(yīng)激組（S組，44只）。從S組與ED組中分別隨機(jī)抽出20只大鼠為應(yīng)激用藥組（S-Y組，20只）和ED用藥組（ED-Y組，20只）。用藥組以伊木薩克片干預(yù)，每日1次，每次250mg/kg，干預(yù)時(shí)間為2周。戊巴比妥鈉麻醉后，大鼠取陰莖組織，-80℃保存。

五、RT-PCR

取50mg陰莖組織，按照miRNeasy Mini Kit試劑盒提取總RNA，Nanodrop 2000微量分光光度計(jì)測(cè)量總R N A濃度，按RT-P C R試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。引物序列：（1）β-actin（F 5'-TTGTAACCAACTGGGACGAT-3' R 5'-GCCAGCCAGGTCCAGACGCA-3' ）；（2）激肽釋放酶1（F 5'-TACTACTTCGGCGAATACCTA-3'R 5'-TCCAATCCGTCAGGTGTGATG-3'）；（3）T-激肽原（F 5'- GCTGGTGCGAGTACAAGAAA-3' R 5'- CTATGGTGTCACGGTTGAAG-3'）。循環(huán)參數(shù)：所有循環(huán)參數(shù)為94℃ 預(yù)變性3min；94℃ 變性30s；56℃ 退火30s；72℃延伸 1min；35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5min。瓊脂糖凝膠電泳：最終的PCR產(chǎn)物用加入EB的2%瓊脂糖凝膠電泳分離，利用UVP凝膠成像系統(tǒng)成像，底片用Image J軟件進(jìn)行分析。

六、Western-blot

用Western-blot方法檢測(cè)激肽釋放酶1、T-激肽原1的蛋白表達(dá)。利用RIPA裂解液提取蛋白，BCA法蛋白定量算出各蛋白濃度，加Loading Buffer沸水煮10 min使蛋白變性后-20℃保存?zhèn)溆茫苊夥磸?fù)凍融。配制5%濃縮膠、12%分離膠，上樣電泳2h，4℃恒壓濕性電轉(zhuǎn)2h。用含有TBST的5%脫脂牛奶封閉非特異性蛋白2h，加入一抗激肽釋放酶1（1：500）、T-激肽原1（1：500），4℃一抗孵育過(guò)夜。次日TBST清洗后室溫二抗孵育2 h，用1% TBST清洗ECL化學(xué)顯影并拍照。

七、免疫組化

取材后陰莖組織用4%甲醛固定，用石蠟包埋制成石蠟切片。運(yùn)用免疫組化SP法進(jìn)行檢測(cè)，按檢測(cè)試劑盒所示步驟進(jìn)行。最終結(jié)果棕黃色胞核及淺黃色胞漿為陽(yáng)性細(xì)胞，藍(lán)色胞核及無(wú)色胞漿為陰性細(xì)胞。在顯微鏡下（放大倍數(shù)400倍）計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，并按陽(yáng)性范圍和著色強(qiáng)度的乘積進(jìn)行評(píng)分并統(tǒng)計(jì)。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（±s）表示，多組數(shù)據(jù)做正態(tài)檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，滿(mǎn)足條件，采用單因素方差分析（ANOVA）；如不滿(mǎn)足條件，求出秩次進(jìn)行方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α＝0.05 。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

一、T-激肽原1與激肽釋放酶1的轉(zhuǎn)錄水平變化

激肽釋放酶1在S組、ED組顯著下調(diào)，經(jīng)藥物伊木薩克片干預(yù)后S-Y、ED-Y組顯著上調(diào)；T-激肽原在S組、ED組顯著上調(diào)，經(jīng)藥物干預(yù)后S-Y、ED-Y組顯著下調(diào)，P＜0.05（見(jiàn)圖1、圖2）。

圖1 各組大鼠陰莖組織 T-激肽原1與激肽釋放酶1的mRNA表達(dá)變化

圖2 各組大鼠陰莖組織T-激肽原1與激肽釋放酶1的mRNA表達(dá)變化

二、T-激肽原1與激肽釋放酶1在陰莖組織的蛋白表達(dá)

激肽釋放酶1在S組、ED組顯著下調(diào)，經(jīng)藥物伊木薩克片干預(yù)后S-Y、ED-Y組顯著上調(diào)；T-激肽原1在S組、ED-組顯著上調(diào)，經(jīng)藥物干預(yù)后S-Y、ED-Y組顯著下調(diào)，P＜0.05（見(jiàn)圖3、圖4）。

圖3 各組大鼠陰莖組織 T-激肽原1與激肽釋放酶1的蛋白表達(dá)變化

圖4 各組大鼠陰莖組織 T-激肽原1與激肽釋放酶1的蛋白表達(dá)變化

三、免疫組化

免疫組化結(jié)果顯示激肽釋放酶1、T-激肽原1在大鼠陰莖組織尿道內(nèi)皮、陰莖海綿體竇及血管內(nèi)皮均有表達(dá)，與正常組相比，S組、ED組激肽釋放酶1表達(dá)顯著降低，經(jīng)伊木薩克片干預(yù)后S-Y組、ED-Y組顯著升高；T-激肽原1在SED組與正常組相比表達(dá)顯著升高，經(jīng)藥物干預(yù)后顯著降低（圖5，表1）。

圖5 各組大鼠陰莖組織免疫組化染色結(jié)果（×400）

表1 免疫組化檢測(cè)大鼠陰莖組織T-激肽原1 、激肽釋放酶1表達(dá)

討 論

陰莖是高度血管化的器官，任何正常內(nèi)皮細(xì)胞功能的破壞都可能影響陰莖血流量并影響勃起功能，血管疾病是ED發(fā)展的重要基礎(chǔ)[3]。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)在ED大鼠模型陰莖組織的HE染色結(jié)果顯示，間質(zhì)纖維化明顯，伴有空泡樣改變，提示水腫明顯，組織中可能有炎性變化，并伴隨血管內(nèi)皮功能損傷，血管內(nèi)皮功能障礙則是導(dǎo)致ED的主要原因之一。激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)是一個(gè)復(fù)雜的內(nèi)源性多酶系統(tǒng)，調(diào)控心血管、神經(jīng)系統(tǒng)等的生理功能，與心臟病、腦血管疾病、炎癥反應(yīng)、腫瘤等疾病的發(fā)生有密切關(guān)系。包括激肽釋放酶原、激肽釋放酶、激肽原、激肽及其受體[5]。研究發(fā)現(xiàn)激肽系統(tǒng)與血管內(nèi)皮功能相關(guān)，可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮增殖、炎癥反應(yīng)等[5,6]，從而引起血管內(nèi)皮功能障礙。

T-激肽原是一種血漿糖蛋白，首先在大鼠血清中被發(fā)現(xiàn)，認(rèn)為是急性炎癥期的一種反應(yīng)物，后來(lái)被發(fā)現(xiàn)是半胱氨酸蛋白酶抑制劑[7]。在大鼠中，有4種類(lèi)型的激肽原，其中兩種是經(jīng)典的高分子量和低分子量的激肽原，其余兩種是低分子量的激肽原，稱(chēng)為“第三”激肽原，命名為T(mén)-激肽原1和T-激肽原2，T-激肽原是大鼠中特有的[8]。我們?cè)谇捌谕ㄟ^(guò)同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（iTRAQ）技術(shù)結(jié)合液相二級(jí)質(zhì)譜（LC-MS-MS）研究了ED大鼠模型，并獲得大鼠血清候選差異蛋白，其T-激肽原在ED大鼠血清中顯著上調(diào)。但T-激肽原在陰莖勃起過(guò)程中和ED發(fā)生發(fā)展中可能的作用尚不清楚。本研究顯示，S組與ED組大鼠模型陰莖組織中T-激肽原1表達(dá)較N組顯著增高，較S組而言ED組有增長(zhǎng)的趨勢(shì)；免疫組化結(jié)果顯示T-激肽原1在海綿竇與血管內(nèi)皮表達(dá)豐富，且S組與ED組表達(dá)量顯著高于N組，提示T-激肽原1可能通過(guò)血管內(nèi)皮增殖或炎癥等反應(yīng)影響內(nèi)皮細(xì)胞功能并在ED發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，經(jīng)藥物干預(yù)后S-Y、ED-Y組大鼠T-激肽原1表達(dá)顯著降低，提示伊木薩克片可能通過(guò)下調(diào)T-激肽原1的表達(dá)，對(duì)ED大鼠模型發(fā)揮治療作用。

激肽釋放酶分為血漿型激肽釋放酶和組織型激肽釋放酶（kallikrein, KLK），組織激肽釋放酶1，屬于絲氨酸蛋白酶家族，是負(fù)責(zé)激肽的產(chǎn)生。組織激肽釋放酶裂解成低分子量激肽原從而產(chǎn)生血管活性肽，其通過(guò)激肽受體發(fā)揮生物學(xué)功能[9]。KLK1已被證實(shí)對(duì)陰莖海綿體平滑肌有較強(qiáng)的舒張效應(yīng)，并且有擴(kuò)張血管保護(hù)血管內(nèi)皮的功能[10]。研究發(fā)現(xiàn)在老年ED大 鼠中KLK1表達(dá)下降，KLK1通過(guò)抑制Ras同源類(lèi)似物A（RhoA ）和Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶1（ROCK1）/LIM激酶2（LIMK2）/絲切蛋白（cofilin）通路的激活，改善海綿體纖維化，保持完整性和效率，最終保護(hù)老年大鼠的勃起功能[11]。進(jìn)一步的研究表明，增強(qiáng)KLK1的表達(dá)可以調(diào)節(jié)二甲基精氨酸二甲胺水解酶（DDAH）/非對(duì)稱(chēng)性二甲基精氨酸（ADMA）/一氧化氮/環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（cGMP）和血小板環(huán)氧化物酶2（COX-2）、 前列腺素合酶（PTGIS）/環(huán)磷酸腺苷（cAMP）途徑，增加cGMP和cAMP的產(chǎn)生，從而改善老年性ED[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，S組、ED組大鼠陰莖組織中KLK1表達(dá)較N 組顯著降低，提示KLK1表達(dá)降低可能導(dǎo)致降低對(duì)平滑肌的舒張效應(yīng)，并影響血管內(nèi)皮功能從而導(dǎo)致ED的產(chǎn)生。而經(jīng)藥物干預(yù)后顯著升高，與N組無(wú)顯著差異，說(shuō)明伊木薩克片可能通過(guò)上調(diào)KLK1的表達(dá)，從而對(duì)ED大鼠模型發(fā)揮作用。同時(shí)，我們?cè)诹硪豁?xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)ED大鼠陰莖組織中RhoA/ROCK1通路發(fā)生了改變，且大鼠陰莖組織中RhoA、ROCK1的表達(dá)顯著升高。結(jié)合本研究結(jié)果，我們認(rèn)為，KLK1表達(dá)改變可能在ED發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用，并和RhoA通路改變存在著內(nèi)在的關(guān)系。

綜上所述，該ED大鼠模型中激肽釋放酶1表達(dá)顯著降低，T-激肽原表達(dá)顯著升高，可能是該ED發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一。而激肽系統(tǒng)在該ED發(fā)生、發(fā)展中的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。