UPLC-MS/MS快速測定煙草中2,4-滴和2,4,5-涕

楊 飛，劉珊珊，鄧惠敏，邊照陽，李中皓，范子彥，王 穎，唐綱嶺

國家煙草質量監督檢驗中心，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2號 450001

2,4-滴和2,4,5-涕是氯代苯氧羧酸類除草劑，廣泛施用于禾谷類作物田、針葉樹林和牧草場等，由于其價格低廉、除草速度較快、除草譜較寬等優點，在生產中一直發揮重要的作用［1-2］。2,4-滴、2,4,5-涕均為低毒除草劑，通過植物葉面、莖稈和根系吸收傳導，阻礙植物激素的正常傳導，從而導致其死亡。但在使用過程中，研究人員發現此類物質可以引起人類軟組織惡性腫瘤，并且對動物體具有胎盤毒性。該類化合物因具有較高的水溶性和遷移性，在煙草生長過程中會被吸收并保留在煙葉中，從而對吸煙者的健康構成威脅［3-4］。2016年，國際煙草科學研究合作中心（CORESTA）農用化學品咨詢委員會（ACAC）制定了106種農用化學品指導性殘留限量（GRL）清單，將煙草中2,4-滴和2,4,5-涕的殘留量上限分別定為0.20和0.05 mg/kg。

2,4-滴和2,4,5-涕可以通過毛細管電泳［5］、液相色譜-紫外檢測器［6-7］、液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）［8-12］、氣相色譜（GC）［13-14］、氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）［15-21］多種方法檢測。由于該類農藥難以氣化，采用GC、GC-MS方法分析時，必須先將該類農藥用重氮甲烷、五氟芐基溴或三甲基硅烷衍生化為易氣化的物質。衍生化后，方法的靈敏度得以大幅提高，但重氮甲烷和三甲基硅烷等衍生化試劑具有較強毒性，而且衍生化過程操作繁瑣，耗時較長。普通液相色譜由于靈敏度低，無法滿足限量要求，因此應用相對較少。近年來，隨著LC-MS/MS選擇性、靈敏度以及抗基質干擾能力的提高，采用LC-MS/MS對各類農藥進行分析的文獻報道逐年增多［8,22-25］，其中Koesukwiwat等［8］、Yang 等［24］和 Liu 等［25］采 用 QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged and Safe）方法分別對稻米和煙草中的2,4-滴和2,4,5-涕進行了提取和LC-MS/MS直接測定，該方法無需衍生化，簡化了樣品前處理過程。但是采用QuEChERS方法時，基質中的極性和非極性共提取物容易對目標物造成干擾，影響定性和定量結果的準確性。因此，在煙草行業標準YC/T 181—2004《煙草及煙草制品 有機氯除草劑農藥殘留量的測定 氣相色譜法》［21］的基礎上進行方法改進，利用超高效液相色譜-串聯質譜技術簡化煙草中2,4-滴和2,4,5-涕的檢測過程，旨在為不同類型煙草樣品中2,4-滴和2,4,5-涕的快速測定提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

30個煙葉樣品全部來自2017年度國家煙草專賣局農殘普查分析樣品，烤煙、白肋煙和香料煙各10個。空白烤煙、空白香料煙和空白白肋煙樣品各1個。所有樣品烘烤后粉碎，過2 mm（10目）篩后置于棕色玻璃瓶中，于4℃下保存。

2,4-滴和2,4,5-涕農藥標準品（＞98.0%，德國Augsburg公司）；二氯甲烷、甲醇（色譜純，德國Merck公司）；鹽酸（37%，體積分數，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；水為超純水。

Waters TQS四極桿串聯質譜儀［配備電噴霧電離源（ESI）］、Waters Acquity I Class超高效液相色譜儀、ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm,1.7 μm）（美國Waters公司）；VX200渦旋振蕩儀（美國Labnet公司）；Turbo Vap氮吹儀（美國Biotage公司）；Milli-Q超純水系統（美國Millipore公司）；AEl63電子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 方法

1.2.1 空白基質提取液的制備

稱取2.0 g空白煙葉樣品于50 mL帶蓋離心管中，加入20 mL 0.5 mol/L鹽酸水溶液和20 mL CH2Cl2，渦旋振蕩15 min；移取下層有機相至儲液瓶中備用，即為空白基質提取液。

1.2.2 基質匹配標準工作溶液的配制

分別稱取25 mg 2,4,5-涕以及100 mg 2,4-滴農藥標準品，于同一個100 mL容量瓶中用甲醇定容，制得2,4,5-涕質量濃度為250 μg/mL，2,4-滴質量濃度為1 000 μg/mL的一級混合標準儲備液。

移取100 μL一級混合標準儲備液于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到2,4,5-涕質量濃度為0.25 μg/mL，2,4-滴質量濃度為 1.0 μg/mL 的二級混合標準儲備液。

分別移取二級混合標準儲備液1 000、500、250、100、50 μL至5個5 mL容量瓶中，用烤煙的空白基質提取液稀釋并定容，制得不同質量濃度的烤煙基質標準工作溶液。烤煙基質標準工作溶液中 2,4,5-涕的質量濃度分別為 50、25、12.5、5.0、2.5 ng/mL；2,4-滴的質量濃度為 200、100、50、20、10 ng/mL。

白肋煙和香料煙基質效應與烤煙不同，因此在實驗中白肋煙和香料煙對應的標準工作溶液應分別用其空白基質提取液稀釋。

1.2.3 樣品的前處理

稱取1.0 g粉碎后的樣品于50 mL帶蓋離心管中，加入10 mL 0.5 mol/L鹽酸水溶液和10 mL CH2Cl2，渦旋振蕩15 min；移取1 mL下層有機相，氮吹近干后用1 mL甲醇復溶，進行UPLC?MS/MS檢測。檢測條件為：

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）柱；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL；流速：0.2 mL/min；流動相：A相為甲醇，B相為0.1%（體積分數）甲酸水溶液；梯度洗脫程序：0~5.0 min為 10%A~90%A，5.0~8.0 min為 90%A，8.0~8.1 min為90%A~10%A，8.1~10.0 min為10%A；質譜掃描方式：負離子掃描；離子源：電噴霧電離源（ESI）；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：450℃；脫溶劑氣流量：800 L/h；錐孔氣流量：150 L/h；停留時間：100 ms；毛細管電壓：3.0 KV；采集模式：多反應監測（MRM）。

2 結果與討論

2.1 實驗條件的優化

2.1.1 流動相的選擇

分別考察水、甲醇、乙腈及其不同比例混合物對2種苯氧羧酸類農藥分離的影響。結果表明，甲醇和乙腈對2種農藥的分離效果相近，考慮到乙腈的毒性較甲醇大，因此選用甲醇-水作為流動相。實驗中同時考察了甲酸對2種農藥電離效果的影響，結果表明，在流動相中加入體積分數為0.1%的甲酸后兩種農藥的信號明顯降低，但是色譜峰形得到明顯改善。原因是：2,4-滴和2,4,5-涕為酸性化合物，在酸性介質中其電離受到抑制，從而使方法的檢出限降低。由于在流動相中加入少量有機酸可以使目標物在經過色譜柱時以分子形式存在，改善其在色譜柱上的保留情況，因此選擇甲醇-水（0.1%甲酸）為流動相。采用優化后的梯度洗脫程序對2種農藥進行分析，其選擇離子色譜圖如圖1所示。可以看出，2種農藥的分離效果較好。

圖1 2,4-滴和2,4,5-涕的選擇離子色譜圖Fig.1 SIM chromatogram of 2,4?D and 2,4,5?T

2.1.2 質譜條件的確定

取200 ng/mL標準溶液，以蠕動注射進樣方式在ESI+和ESI-模式下進行全掃描。結果顯示，在負離子（ESI-）模式下，［M-H］-和［M-H+2］-豐度較高，因此選擇［M-H］-為定量離子的母離子，［M-H+2］-為定性離子的母離子。以［M-H］-和［M-H+2］-為前體離子，進行產物離子掃描，選取豐度較強、信號穩定的碎片離子作為定性和定量離子。最后，優化毛細管電壓、離子源溫度、錐孔電壓、碰撞電壓等參數條件，使各個離子對的信號響應最高。優化確定的2種農藥的質譜參數如表1所示。

表1 2,4-滴和2,4,5-涕的質譜參數①Tab.1 MS parameters for 2,4?D and 2,4,5?T

2.1.3 萃取溶劑及其體積的確定

針對苯氧羧酸類農藥的極性和溶解度，選取不溶于水的二氯甲烷、甲苯和乙酸乙酯作為萃取溶劑。在加入10 mL鹽酸水溶液提取后，分別加入10、20、30 mL的二氯甲烷、甲苯或乙酸乙酯進行萃取，萃取結果如表2所示。在3種有機溶劑中，當溶劑體積為10 mL時，甲苯的萃取效果與二氯甲烷接近，但甲苯對目標物色譜峰形影響較大，峰展寬現象較嚴重，且出現峰分裂現象；加入二氯甲烷后，樣品譜圖中目標物的峰形較好，且雜質峰較少。綜上考慮，選擇二氯甲烷作為萃取溶劑。

當1.0 g烤煙、白肋煙和香料煙樣品中2種農藥的含量（質量分數）為5倍GRL（指導性農藥殘留限量）值時，使用10 mL二氯甲烷的平均回收率均大于90%；進一步增加有機溶劑體積時，萃取效率基本不變，但檢測靈敏度下降，因此選擇二氯甲烷的體積為10 mL。

表2 萃取溶劑在不同萃取比例下的萃取效率Tab.2 Effects of extraction agents on recoveries of 2,4,5?T and 2,4?D at different volume ratios

2.1.4 HCl濃度的確定

HCl的濃度會影響到苯氧羧酸類農藥的質子化效果，從而影響其提取效果。在1.0 g烤煙、白肋煙和香料煙樣品中2種農藥的含量為5倍GRL濃度水平上，分別比較了0.25、0.5、1.0 mol/L HCl水溶液對2種農藥的提取效果。結果（圖2）顯示，用0.5和1.0 mol/L HCl水溶液提取時，平均回收率相當，但用1.0 mol/L HCl水溶液時樣品提取液的顏色較深，基質干擾較大，因此選擇0.5 mol/L HCl水溶液作為提取溶劑。

圖2 HCl濃度對提取效率的影響Fig.2 Effect of HCl concentration on recovery

2.1.5 振蕩時間的確定

振蕩提取是液-液萃取分析的重要環節之一。在1.0 g烤煙、白肋煙和香料煙樣品中2種農藥的含量為5倍GRL濃度水平上，采用3種振蕩萃取時間，即渦旋劇烈振蕩5、15和30 min，比較振蕩時間對回收率的影響。結果（圖3）顯示，振蕩萃取5 min時平均回收率較低。為了提高檢測效率，且不影響回收率，選擇渦旋振蕩15 min。

2.1.6 基質效應的考察

在樣品提取過程中，提取液中的共提物會影響目標物的定性、定量分析結果，這種現象稱之為基質效應。通常，通過配制基質標準工作溶液來解決基質效應問題。為了考察不同基質對各種除草劑響應的影響，分別用白肋煙、香料煙、烤煙的空白提取液配制50 ng/mL溶液，將其響應值與利用甲醇配制的同濃度溶液的響應值進行對比。各樣品中目標物響應強度與標準溶液響應強度的比值如表3所示。可以看出，不同類型的煙草樣品基質對2種目標物的響應信號均有不同程度的抑制作用。因此，為了避免基質效應給定量結果帶來干擾，本實驗中對于不同類型的煙草樣品，采用其對應的空白基質提取液配制標準工作曲線。

圖3 振蕩時間對回收率的影響Fig.3 Effect of oscillation time on recovery

表3 不同類型煙草的基質效應Tab.3 Matrix effects of different types of tobacco samples

2.2 方法評價

2.2.1 標準曲線、檢出限和定量限

以各農藥定量離子對的色譜峰面積（Y，cps）為縱坐標，濃度（X，ng/mL）為橫坐標作圖，得到標準工作曲線。分別以3倍和10倍信噪比（S/N）確定檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。結果（表4）顯示，2個目標物的線性關系良好，相關系數高于0.999，可以滿足定量分析要求。

2.2.2 方法的回收率及精密度

通過加標樣品的回收率實驗驗證該方法的重復性及精密度（RSD）。采用不同濃度水平（LOQ，GRL，5倍GRL）的加標樣品進行回收率實驗。每個濃度水平進行5次平行測定，計算樣品中2種除草劑的回收率和RSD。結果（表5）顯示，3種不同類型煙草樣品的回收率分別為80.4%~94.6%、80.8%~92.6%和79.5%~94.4%，且RSD均小于6.0%。

表4 2,4-滴和2,4,5-涕的標準工作曲線、相關系數、檢出限及定量限Tab.4 Standard working curves,correlation coefficients,LODs and LOQs of 2,4-D and 2,4,5-T

表5 不同煙葉中2,4-滴和2,4,5-涕的回收率和精密度（n=5）Tab.5 Recoveries and precisions of 2,4?D and 2,4,5?T in different tobaccos（n=5）

2.2.3 與現有方法的對比

煙草行業標準 YC/T 181—2004［21］采用三甲基氫氧化硫將苯氧羧酸類農藥衍生化為相應的甲酯，然后進行GC-MS檢測。采用本方法對烤煙、白肋煙和香料煙樣品各10個進行檢測，結果顯示，僅4個樣品中檢出2,4-滴或2,4,5-涕，其余樣品均未檢出2種目標物。采用本方法與標準方法對4個含有目標物的煙草樣品進行檢測和對比分析，結果（表6）顯示，本方法檢測結果與標準方法檢測結果之間無明顯差異，說明兩種方法的一致性良好。

表6 不同方法的測定結果對比①Tab.6 Comparison of testing results of different methods（mg·kg-1）

2.2.4 能力驗證實驗

采取盲樣測試的方式進行FAPAS（Food Analysis Performance Assessment Scheme）國際能力驗證實驗。各實驗室按照自建方法對樣品進行定性和定量分析。在2018年FAPAS國際能力驗證實驗中，采用本方法對樣品進行定性和定量分析。樣品為白肋煙，2,4-滴的設計值是0.50 mg/kg。各實驗室結果如表7所示。本實驗室檢測結果為0.59 mg/kg，Z值為1.0，說明檢測能力令人滿意。

表7 能力驗證實驗結果Tab.7 Results of capability verification experiment

3 結論

通過優化質譜條件、色譜條件及樣品前處理過程等，建立了快速測定煙草中2,4-滴和2,4,5-涕兩種氯代苯氧羧酸類除草劑的UPLC-MS/MS方法。在本實驗條件下，2,4-滴和2,4,5-涕的回收率在79.5%~94.6%之間，RSD在3.8%~5.9%之間，與煙草行業標準方法相比，結果無明顯差異。FAPAS國際能力驗證實驗結果表明，本方法可用于盲樣的準確定性定量分析。本方法以空白基質配制標準工作溶液，前處理簡單快速，定量結果準確可靠，適用于煙草中該類農藥殘留的分析。