洛陽煙區(qū)煙株根圍抗煙草疫霉放線菌的篩選與鑒定

陳奇園，丁鑰琪，趙世民，李淑君，康業(yè)斌*

1.河南科技大學林學院，河南省洛陽市開元大道263號 471023

2.河南省煙草公司洛陽市公司，河南省洛陽市開元大道246號 471023

3.河南省農(nóng)科院許昌煙草研究所，河南省許昌市魏都區(qū)永昌大道 461000

由煙草疫霉（Phytophthora parasitica var.nicotianae）侵染煙草引起的黑脛病是一種分布廣泛、危害嚴重的毀滅性土傳真菌病害［1］。目前，煙草黑脛病的防治措施主要采用種植抗病品種、合理輪作與藥劑防治。然而，隨著煙草栽培制度的改變，抗病品種連年、大面積單一種植，極易導致其抗病性喪失。生產(chǎn)上常用的甲霜靈等幾種內(nèi)吸性殺菌劑對煙草疫霉作用位點單一，容易產(chǎn)生抗藥性而引起藥效下降，從而導致藥劑用量加大，使煙葉中的農(nóng)藥殘留增加、造成環(huán)境污染［2-4］。近年來，國內(nèi)外學者相繼開展了拮抗放線菌防治煙草病害的研究。Lukic等［5］從煙田土壤中分離出28株放線菌，其中兩株對12種煙草病原真菌有拮抗作用；Kortemaa等［6］報道了世界上已廣泛應(yīng)用的一種放線菌的活體制劑防治腐霉菌、疫霉菌、鐮刀菌和絲核菌等常見的土傳病原菌；Loqman等［7］從摩洛哥葡萄根際土壤中分離獲得142株放線菌，并測定了對尖孢鐮刀菌、終極腐霉、大麗輪枝菌、灰葡萄孢菌及白絹病菌的拮抗作用，其中有24株放線菌至少抗4種病原菌。周喜新等［8］從湖南長沙瀏陽市北盛鎮(zhèn)煙草黑脛病發(fā)病田健株根際土壤中分離純化獲得1株對煙草疫霉具有顯著拮抗作用的放線菌LY18，其發(fā)酵液對煙草疫霉菌絲的抑制率達70%；王靜等［9］從山東省日照市五蓮縣于里鎮(zhèn)煙田健株根際土壤分離純化獲得1株拮抗放線菌F8，室內(nèi)測定對供試煙草疫霉具有較強的抑制作用，溫室盆栽試驗防效為70.3%。但河南省煙田土壤中拮抗放線菌種類及開發(fā)應(yīng)用尚未見系統(tǒng)研究報道，為此，進行了洛陽地區(qū)煙草根圍土壤中拮抗放線菌的篩選與鑒定，旨在為進一步開發(fā)利用拮抗微生物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

煙 草 疫 霉（Phytophthoraparasiticavar.nicotianae）以及從煙草根圍土壤分離的放線菌稀釋涂布平板均由河南科技大學植物病害分子鑒定與綠色防控實驗室保存。

試驗所用培養(yǎng)基包括：高氏一號瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、大豆酵母培養(yǎng)基、淀粉銨瓊脂培養(yǎng)基、蔗糖察氏瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖天門冬素瓊脂培養(yǎng)基、克氏一號瓊脂培養(yǎng)基和葡萄糖酵母膏瓊脂培養(yǎng)基。細菌基因組DNA快速抽提試劑盒（編號：B518255）和 PCR擴增試劑盒（編號：B532491）購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 根圍放線菌的純化

將高氏一號培養(yǎng)基融化，待冷卻至50℃左右，加入3%的重鉻酸鉀溶液使培養(yǎng)基中重鉻酸鉀濃度約100 mg/L，倒平板；待平板凝固后備用，用滅菌牙簽從前期試驗保存的稀釋涂布平板上挑出菌落形態(tài)或顏色不同的放線菌單菌落至高氏一號平板上劃線分離、純化培養(yǎng)［10］，直至獲得單菌落。

1.2.2 拮抗菌株的篩選

1.2.2.1 拮抗菌株的初篩

采用改良的平板對峙培養(yǎng)法［11］測定菌株對煙草疫霉的拮抗作用，保留抑菌率≥50%的菌株進行復選。

1.2.2.2 拮抗菌株的復篩

采用菌絲生長速率法［12］測定初選菌株發(fā)酵液對煙草疫霉的抑菌活性，選取抑菌率達100%的菌株進一步鑒定其種類。

1.2.3 拮抗菌株的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)及培養(yǎng)特征觀察

用插片法［13］在普通光學顯微鏡（無錫瀚光光學科技有限公司）100倍油鏡下觀察記載其基內(nèi)菌絲體有無橫隔、是否斷裂；氣生菌絲體的特征；孢子鏈的形狀、著生方式；孢子的形狀等。

根據(jù)《鏈霉菌鑒定手冊》［14］，將菌株分別接種在高氏一號瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、淀粉銨瓊脂培養(yǎng)基、蔗糖察氏瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖天門冬素瓊脂培養(yǎng)基、克氏一號瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖酵母膏瓊脂培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)，分別在7、14、28 d后觀察菌株在不同培養(yǎng)基上氣生菌絲、基內(nèi)菌絲的生長狀況，是否有可溶性色素產(chǎn)生及其顏色。

1.2.3.2 生理生化特征觀察

參照《植病研究法》［12］和《放線菌的分類和鑒定》［15］進行明膠液化、牛奶凝固和胨化、淀粉分解、纖維素水解、硫化氫與黑色素產(chǎn)生以及利用碳源產(chǎn)酸等試驗，觀察生理生化特征。

1.2.3.3 16S rDNA序列分析

按照細菌基因組DNA快速抽提試劑盒（編號：B518255）說明書進行放線菌DNA的提取。以提取的DNA為模板，采用通用引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′對放線菌16S rDNA序列進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：模板DNA 1.0 μL，10×Taq Buffer（NH4+）5.0 μL，dNTP Mix（10.0 mmol/L）1.0 μL ，Taq DNA Polymerase（5 U/μL）0.25 μL，MgCl2（25 mmol/L）3.0 μL，上下游引物（10.0 μmol/L）各 1.0 μL，加 dd H2O 補至 50 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預變性2 min；94℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。檢測到合適的條帶后，將其所對應(yīng)的原始擴增產(chǎn)物（未純化，45 μL）由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序得到的序列在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST比對，用MEGA.6軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［16］。

2 結(jié)果與分析

2.1 根圍放線菌的純化

共挑出放線菌單菌落496個，進一步分離純化獲得形態(tài)或顏色不同的放線菌單菌落227個。

2.2 拮抗菌株的篩選

2.2.1 拮抗菌株的初篩

表1顯示，有45株放線菌對煙草疫霉的抑菌率大于50%，其中25株的抑菌率大于70%。

表1 放線菌對煙草疫霉的抑制作用①Tab.1 Inhibition effects of actinomycetes against P.parasitica

2.2.2 拮抗菌株的復篩

表2表明，15株拮抗放線菌的發(fā)酵液對煙草疫霉的抑菌率大于50%。其中，菌株YY75、YY124、LN204、LN221、LN247、SX92、YY135 和SX59的抑菌率達100%，確定為優(yōu)勢拮抗菌株。

2.3 優(yōu)勢拮抗菌株的鑒定

2.3.1 形態(tài)及培養(yǎng)特征觀察

菌株YY75孢子絲彎曲，孢子圓形；菌株LN204、LN221和LN247孢子絲螺旋形，孢子圓柱狀；菌株SX92孢子絲波曲，孢子桿狀；菌株YY124和YY135孢子絲圈卷，孢子桿狀；菌株SX59孢子絲螺旋形，孢子桿狀（圖1）。

表2 拮抗放線菌對煙草疫霉的抑制作用Tab.2 Inhibition effects of antagonistic actinomycetes against P.parasitica

在高氏一號瓊脂培養(yǎng)基上，菌株YY75氣生菌絲白色，基內(nèi)菌絲乳脂色至紫紅色，無可溶性色素；菌株LN204、LN221和LN204氣生菌絲白至灰色，基內(nèi)菌絲蜜黃色，無可溶性色素；菌株SX92氣生菌絲白色，基內(nèi)菌絲乳脂色，無可溶性色素；菌株YY124和YY135氣生菌絲白色至粉紅色，基內(nèi)菌絲紫紅色，無可溶性色素；菌株SX59氣生菌絲白色至粉紅色，基內(nèi)菌絲紫紅色，無可溶性色素。

在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，菌株YY75氣生菌絲白色，基內(nèi)菌絲乳脂色至褐色，可溶性色素黃色；菌株LN204、LN221和LN204少量灰色氣生菌絲，基內(nèi)菌絲米黃色，無可溶性色素；菌株SX92氣生菌絲白色，基內(nèi)菌絲褐綠至橄欖灰綠色，可溶性色素墨綠色；菌株YY124和YY135無氣生菌絲，基內(nèi)菌絲紫紅色，無可溶性色素；菌株SX59氣生菌絲粉紅色，基內(nèi)菌絲紫紅色，可溶性色素米色。

在淀粉銨瓊脂培養(yǎng)基上，菌株YY75無氣生菌絲，基內(nèi)菌絲米綠色，無可溶性色素；菌株LN204、LN221和LN204氣生菌絲白至鼠灰色，基內(nèi)菌絲微褐，無可溶性色素；菌株SX92無氣生菌絲，基內(nèi)菌絲米綠色，無可溶性色素；菌株YY124和YY135氣生菌絲粉紅至石南紫，基內(nèi)菌絲玫瑰色至紫紅色，無可溶性色素；SX59氣生菌絲古粉紅色，基內(nèi)菌絲玫瑰色至信號紅，無可溶性色素。

在蔗糖察氏瓊脂培養(yǎng)基上，菌株YY75無氣生菌絲，基內(nèi)菌絲乳脂色至米綠色，無可溶性色素；菌株LN204、LN221和LN204氣生菌絲沙紫灰至暗灰色，基內(nèi)菌絲淺灰至灰黃色，無可溶性色素；菌株SX92氣生菌絲白色，基內(nèi)菌絲硫磺色，可溶性色素黃色；菌株YY124和YY135氣生菌絲白色至粉紅色，基內(nèi)菌絲橘紅至寶石紅，無可溶性色素；菌株SX59氣生菌絲白色至粉紅色，基內(nèi)菌絲橘紅至寶石紅，無可溶性色素。

在葡萄糖天門冬素瓊脂培養(yǎng)基上，菌株YY75無氣生菌絲，基內(nèi)菌絲乳脂色至紫紅色，無可溶性色素；菌株LN204、LN221和LN204無氣生菌絲，基內(nèi)菌絲無色至微黃，無可溶性色素；菌株SX92無氣生菌絲，基內(nèi)菌絲乳脂色，無可溶性色素；菌株YY124和YY135氣生菌絲白色，基內(nèi)菌絲石南紫至酒紅紫，無可溶性色素；菌株SX59氣生菌絲白色，基內(nèi)菌絲酒紅紫，無可溶性色素。

圖1 菌株的孢子絲和孢子形態(tài)（×100）Fig.1 Spore chains and spore morphology of antagonistic strains（×100）

在克氏一號瓊脂培養(yǎng)基上，菌株YY75氣生菌絲白色，基內(nèi)菌絲乳脂色至葡萄酒紅，無可溶性色素；菌株LN204、LN221和LN204氣生菌絲淺黃色至灰色，基內(nèi)菌絲蜜黃色，無可溶性色素；菌株SX92氣生菌絲白色，基內(nèi)菌絲乳脂色，無可溶性色素；菌株YY124和YY135氣生菌絲粉紅至古粉紅色，基內(nèi)菌絲粉紅至紫紅色，無可溶性色素；菌株SX59氣生菌絲白色至粉紅色，基內(nèi)菌絲粉紅至橘紅，無可溶性色素。

在葡萄糖酵母膏瓊脂培養(yǎng)基上，菌株YY75無氣生菌絲，基內(nèi)菌絲為象牙色至赭黃色，可溶性色素為黃棕色；菌株LN204、LN221和LN204氣生菌絲為白至灰色，基內(nèi)菌絲米為褐色，無可溶性色素；菌株SX92氣生菌絲為白色，基內(nèi)菌絲為米褐色，可溶性色素為棕色；菌株YY124和YY135氣生菌絲為白色，基內(nèi)菌絲為象牙色至火焰紅，無可溶性色素；菌株SX59氣生菌絲為粉紅色，基內(nèi)菌絲也為粉紅色，無可溶性色素。

2.3.2 生理生化特性

優(yōu)勢拮抗菌株均可利用葡萄糖、麥芽糖、阿拉伯糖和甘露醇等多種碳源，明膠液化、纖維素水解均為陽性，而硫化氫的產(chǎn)生均為陰性；菌株YY135對牛奶的凝固和胨化反應(yīng)為陽性；菌株YY75和SX92黑色素的產(chǎn)生反應(yīng)也為陽性，見表3。

表3 優(yōu)勢拮抗菌株的生理生化特征①Tab.3 Physiological and biochemical characteristics of dominant antagonistic strains

2.3.3 16S rDNA序列分析

將菌株LN204、LN221、LN247、SX59、YY124、YY135、YY75和SX92的16S rDNA序列提交至NCBI，登 錄 號 分 別 為 MH265958、MH265959、MH265960、MH265965、MH265966、MH265967、MH265968和MH265970。進一步對8個菌株的16S rDNA序列進行BLAST比對，用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。結(jié)果表明，菌株YY75的序列與登錄號為NR043827（Streptomyces lucensis）等序列同源性大于99%，菌株YY124和YY135的序列與登錄號為AB184370（S.nobilis）等序列同源性大于99%，菌株LN204、LN221和LN247的序列與登錄號為JX284411（S.rochei）等序列同源性大于99%，菌株SX92的序列與登錄號為AB184197（S.coralus）等序列同源性大于99%，菌株SX59的序列與登錄號為 AB249919（S.aureoverticillatus）等序列同源性大于99%。

3 討論

本試驗中鑒定的8株優(yōu)勢拮抗放線菌均屬于鏈霉菌屬，這與邊傳紅［17］從洛陽煙草根際土壤中篩選鑒定的13株拮抗放線菌也均屬于鏈霉菌屬的結(jié)果一致；也與廖振林等［18］從廣西北海紅樹林土壤中篩選鑒定的10株拮抗放線菌，其中有8株屬于鏈霉菌屬的結(jié)果一致。說明鏈霉菌屬是土壤放線菌中常見的屬。本試驗中獲得的優(yōu)勢拮抗放線菌發(fā)酵液對煙草疫霉抑制率均達100%，說明發(fā)酵液中含有抑菌活性成分，這與Singh等［19］發(fā)現(xiàn)的S.lucensis可以產(chǎn)生魯薩霉素C和Anukool等［20］發(fā)現(xiàn)的S.rochei F20可以產(chǎn)生抗生素Streptothricin的試驗結(jié)果一致，說明鏈霉菌屬是放線菌中主要產(chǎn)抗生素的屬。但有關(guān)鏈霉菌屬發(fā)酵液中活性成分分析、抑菌機理的研究以及盆栽防效試驗與田間防治效果等仍有待進一步的深入研究。

圖2 優(yōu)勢拮抗菌株16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of dominant antagonistic strains based on 16S rDNA sequences

4 結(jié)論

從洛陽煙區(qū)煙株根圍土壤中分離純化共獲得227個放線菌單菌落，其中8株的發(fā)酵液對煙草疫霉菌絲生長的抑制率達100%，被確定為優(yōu)勢拮抗放線菌。根據(jù)這些菌株的形態(tài)學觀察、生理生化反應(yīng)和16S rDNA序列分析結(jié)果，菌株YY75鑒定為魯薩鏈霉菌（S.lucensis），菌株YY124和YY135鑒定為高貴鏈霉菌（S.nobilis），菌株LN204、LN221和LN247鑒定為婁徹鏈霉菌（S.rochei），菌株SX92鑒定為珊瑚鏈霉菌（S.coralus），菌株SX59鑒定為金黃回旋鏈霉（S.aureoverticillatus），均屬于放線菌門、放線菌綱、鏈霉菌目、鏈霉菌科、鏈霉菌屬。