HBV前C區A1896基因突變的探討及臨床用藥研究

王 涵，郭志鋼

（1.長春中醫藥大學附屬醫院檢驗科，長春 130021；2.吉林大學中日聯誼醫院神經外科，長春 130033）

乙型肝炎由乙肝病毒（HBV）引起，屬于嗜肝病毒，這種病毒喜歡在肝臟中生存，或者說肝臟適合它生存下來，并“繁衍后代”，有的專家形象地稱乙肝病毒為“肝細胞的寄生蟲”。乙型肝炎病毒（HBV）是一種很小的病毒，它屬于嗜肝脫氧核糖核酸（DNA）病毒組中的一個成員。病毒顆粒由外膜和內核兩部分組成，完整的HBV顆粒是直徑42 nm的球形顆粒，其外膜厚7 nm，由蛋白質和膜脂質組成，稱作乙型肝炎表面抗原（HBsAg）。由于其最早在澳大利亞發現，所以曾被稱為“澳大利亞抗原”，簡稱“澳抗”。中心部分的直徑約28 nm，為病毒的核心，其中包括核心抗原（HBcAg）和e抗原（HBeAg），內核中心含有病毒基因（DNA）和DNA多聚酶。慢性乙型肝炎是指乙肝病毒檢測為陽性，病程時間較長或有慢性肝炎表現者。根據乙肝病毒e抗原分為乙肝病毒e抗原陽性和乙肝病毒e抗原陰性的慢性乙型肝炎。近年來臨床上越來越多的研究發現乙肝病毒e抗原陰性的慢性乙型肝炎患者乙肝病毒脫氧核糖核酸（HBV DNA）載量很高。HBV-DNA即是乙肝病毒的脫氧核糖核酸,其兩鏈長短不一，長鏈（L）完整，為負鏈，長度恒定，約3 200個核苷酸。短鏈（S）為正鏈，長度可變，約為長鏈長度的50～100%，鏈的增生按5′-3′順序進行。在不同分子中短鏈3′端的位置是可變的，而短鏈和長鏈的5′端位置固定點為粘性末端，通過250～300個核苷酸堿基配對，以維持DNA分子的環狀結構。在粘性末端兩側，兩鏈5′端各有一個由11個bp組成的直接重復序列（Direct repeat DR）-5′TTCACCTCTCC，該DR位于第1824個核苷酸者稱DR1，位于第1590個核苷酸者稱DR2，在病毒復制中起作用，HBV-DNA陽性提示病毒復制活躍。核苷（酸）類似物主要是抗病毒，提高免疫及恢復肝功，具有不良反應少等優勢，在臨床上被廣泛用來抗病毒治療[1]。由于核苷類似物可以抑制乙肝病毒復制的轉錄環節，并無直接清除作用，就需要長期的用藥[2]。實驗對慢性乙型肝炎e抗原陰性的患者做A1896位點變異檢測與臨床用藥進行觀察研究。

1 材料與方法

1.1 病理資料及標準 所有標本均來自長春中醫藥大學附屬醫院住院患者。選取慢性乙型肝炎患者230例且乙肝病毒e抗原陰性，排除藥物性、酒精性、自身免疫性和代謝性肝病。

1.2 儀器與實驗方法 熒光定量PCR測定儀；貝克曼DXI800； 電化學發光方法檢測乙型肝炎；熒光定量PCR檢測HBV-DNA；熒光定量PCR檢測HBV1896位點變異。

1.3 PCR擴增 實時熒光技術對核酸進行定量檢測，核酸提取開始加入內標，內標經過核酸提取后進行PCR擴增。

1.4 結果判定 待測樣品在混合液A檢測Ct值≤38，混合液B為陰性，判斷待檢樣品為HBV1896變異型，如果Ct值在38～40之間，重復檢測一次，如果Ct值仍在38～40之間，則判斷為陰性。

1.5 統計學方法 樣本均數比較采用t檢驗，率的比較采用χ2檢驗，P值取雙側，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乙肝病毒e抗原陰性的患者體內病毒復制情況 在230例患者中HBV-DNA陽性的有168例，占總人數的44.2%，陽性以HBV-DNA＞102copies/mL為標準，見表1。

2.2 HBV-DNA的滴度與A1896位點變異情況分析 依據病毒含量進行分組，研究顯示病毒載量與A1896位點的變異存在一定的關系，病毒載量在5×106及以上時，變異率越高,差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表1 乙肝病毒e抗原陰性病毒載量分析

表2 病毒載量與變異情況分析

2.3 核苷類抗病毒藥物治療A1896位點變異療效的分析 本實驗應用3種核苷類抗病毒藥物對1896位點變異和未變異的患者進行療效判斷，觀察其單藥用藥時間為3～6個月的療效。研究發現，恩替卡韋變異組治療效果顯著（P＜0.05），見表3。

表3 單藥治療變異組與未變異組的比較

3 討論

乙型肝炎病毒侵入機體后，在肝細胞內進行復制繁殖。乙型肝炎病毒基因組DNA在肝細胞核內進行復制，轉錄，在合成核心顆粒后，被轉運到肝細胞漿內，在通過內質網和細胞膜時合成其外殼部分，并以發芽的形式釋放出肝細胞。實驗發現乙肝病毒e抗原陰性不代表患者病毒停止復制，需要做病毒載量的檢測。Pollicino等對40例乙型肝炎患者的檢測研究中發現基因突變對乙肝的復制能力無影響[3]，與本實驗結果相符。慢性乙肝病毒感染的過程比較復查，需要經歷四個時期[4]，乙型肝炎感染的各期是否與病毒載量存在相關性影響，將進行下一步研究。人體感染乙型肝炎病毒后，可引起細胞免疫及體液免疫應答，并激發自身免疫反應及免疫調節功能紊亂，致使病變的肝細胞產生或釋放大量正常或異常的蛋白質，進一步促使免疫損害加重，使病情不斷發展。核苷類似物治療A1896位點變異的慢性乙型肝炎患者時，恩替卡韋的療效顯著。對慢性乙型肝炎期患者，A1896位點突變應盡快接受治療，包括抗病毒、免疫調節、抗炎、改善肝功能和抗肝纖維化治療等，但關鍵是抗病毒治療。其目標是最大限度地長期抵制或消除HBV，減輕肝細胞炎癥及其所致的肝纖維化，延緩疾病進展，減少肝硬化，原發性肝癌及其并發癥的發生，從而延長病人的生存時間和生活質量。目前，乙肝的抗病毒治療已經有了大幅的進展，但受病毒的變異、人體免疫耐受等因素的影響，容易產生耐藥性，故研制高效低毒的抗病毒藥勢在必行。