基于NF-κb信號(hào)通路探究當(dāng)歸四逆湯對(duì)糖尿病大鼠周圍神經(jīng)病變保護(hù)作用機(jī)制

程思宇，周曉晶，李 欣，武冬璐，錢婷婷，張文風(fēng)

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117）

糖尿?。―M）是由多病因引起的的慢性代謝性疾病，發(fā)病率逐年升高，可嚴(yán)重危及到腦、心、眼睛、腎、周圍神經(jīng)等，困擾著人們的生活，糖尿病周圍神經(jīng)病變是其常見并發(fā)癥[1,2]。中醫(yī)認(rèn)為糖尿病周圍神經(jīng)病變?yōu)橄嗜站檬е危帗p氣耗傷陽(yáng)，陽(yáng)虛寒生，導(dǎo)致血凝不暢，氣機(jī)阻滯，痹阻脈絡(luò)，使陽(yáng)氣不能達(dá)于四末，肌肉筋脈失于溫煦濡養(yǎng)所致[3-6]。根據(jù)其發(fā)病機(jī)理，選用溫經(jīng)散寒，養(yǎng)血通絡(luò)的當(dāng)歸四逆湯進(jìn)行糖尿病周圍神經(jīng)病變治療。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，當(dāng)歸四逆湯具有擴(kuò)張血管，改善微循環(huán)之功效，可使?fàn)I養(yǎng)充分供給到周圍神經(jīng)，從而對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變起到積極的治療作用[7,8]。本課題組在前期研究的基礎(chǔ)上，以NF-κb信號(hào)通路為靶點(diǎn)，旨在深入探討當(dāng)歸四逆湯在DPN發(fā)生發(fā)展中的作用，揭示其治療作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 Wistar雄性大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，選自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，合格證號(hào)為SCXK（遼）2015-0001。

1.2 藥物與試劑 當(dāng)歸四逆湯所含中藥，購(gòu)于吉林省長(zhǎng)春市同仁堂藥房，常規(guī)方法水煎煮，制成2 g/mL，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩８袢A止鹽酸二甲雙胍片，長(zhǎng)春寬城區(qū)鴻陽(yáng)大藥房，產(chǎn)品批號(hào)14120045，鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）系Sigma 公司生產(chǎn)，RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物科技有限公司。葡萄糖試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 臺(tái)式高速低溫冷凍離心機(jī)（上海醫(yī)療器械有限公司），臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)sigma），全自動(dòng)酶標(biāo)儀ELx808（美國(guó)BioTek儀器有限公司），熒光定量PCR儀（美國(guó)伯樂公司）。

1.4 模型建立與分組給藥 將大鼠適應(yīng)性飼喂1周后，預(yù)留空白組，將造模大鼠禁食不禁水12 h后，使用2%鏈脲佐菌素按55 mg/kg劑量單次左側(cè)腹腔注射，正常喂養(yǎng)72 h 后取尾靜脈血糖，以隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L 作為成模標(biāo)準(zhǔn)[4]。將糖尿病大鼠喂養(yǎng)6周后，進(jìn)行大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)檢查，確實(shí)驗(yàn)組是否出現(xiàn)周圍神經(jīng)病變。將確定成模的48只大鼠隨機(jī)分為模型組、當(dāng)歸四逆湯高劑量組、當(dāng)歸四逆湯低劑量組、二甲雙胍組，每組12只，將同批血糖值在正常范圍內(nèi)的12只大鼠定為空白組，造模成功后開始灌胃給藥，中藥高劑量為7.36 g/kg/d、中藥低劑量組1.84 g/kg/d、二甲雙胍組140 mg/kg/d，根據(jù)1 mL/100g體重的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行空白組和模型組生理鹽水灌胃，1次/d，8周后處死大鼠。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1 血糖檢測(cè) 大鼠血糖采用血糖葡萄糖氧化酶法檢測(cè)，觀察當(dāng)歸四逆湯對(duì)糖尿病大鼠空腹血糖的影響。

1.5.2 坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度檢測(cè) 根據(jù)大鼠體質(zhì)量與狀態(tài)，選用0.9%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉后，將大鼠俯臥位固定。刺激雙激雙針電極置于其左側(cè)坐骨切跡處，右足底第2趾間放置記錄電極，參考電極在激電極與記錄電極之間，距離記錄電極約1 cm。采用波寬0.1 m/s，刺激強(qiáng)度閾值1.5倍，刺激間隔5s以上的單脈沖方波刺激后，按時(shí)記錄測(cè)定的肌電圖。標(biāo)本處死前需進(jìn)行大鼠坐骨神經(jīng)運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)速度測(cè)定。實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格控制室溫（20±5）℃，保持動(dòng)物體溫在37℃左右。

1.5.3 大鼠坐骨神經(jīng)NF-κb蛋白檢測(cè) 將各組大鼠坐骨神經(jīng)標(biāo)本固定、脫水，透明，浸蠟，包埋后制成石蠟切片，常規(guī)方法進(jìn)行脫蠟至水，經(jīng)抗原熱修復(fù)后，滴加3% H2O2，10 min，封閉內(nèi)源性過氧化物酶，分別滴加抗大鼠NF-κb單克隆抗體（1：50），37 ℃，2 h，辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG多克隆抗體，37 ℃，30 min，DAB 顯色，陰性正常采用PBS 代替一抗。高倍鏡視野（×400）下隨機(jī)選擇10個(gè)視野觀察切片，運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)數(shù)心肌細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞積分光密度值（IOD）。

1.5.4 大鼠坐骨神經(jīng)NF-κb mRNA的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠，取坐骨神經(jīng)組織，提取總RNA。按照試劑盒說明加樣，完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，熒光定量 q PCR儀擴(kuò)增。NF-κb與內(nèi)參GAPDH引物，均選自上海生工生物技術(shù)公司。用儀器自帶的分析軟件統(tǒng)計(jì)分析，將對(duì)照組設(shè)定為 1，相對(duì)定量值為RQ 。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 當(dāng)歸四逆湯對(duì)血糖影響 經(jīng)實(shí)驗(yàn)造模后的各組與空白組相比較，血糖值均明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療組與模型組血糖相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（ P＞0.05）；與模型組相比，經(jīng)當(dāng)歸四逆湯治療后大鼠血糖較干預(yù)前明顯改善，其中治療組間血糖在各時(shí)間點(diǎn)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P＞0.05），見表1。

2.2 當(dāng)歸四逆湯對(duì)DPN大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度（MNCV）的影響 模型組與空白組比較顯示，坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯降低（P＜0.05）；中藥復(fù)方各治療組與模型組和二甲雙胍組比較坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度顯著增快，且高劑量組效果最為顯著（P＜0.05），見表2。

表1 各組血糖比較（± s） mmol/L

表1 各組血糖比較（± s） mmol/L

注：與模型組比較，# P＜0.05

組 別 例數(shù) 血糖空白組 12 5.420±0.47模型組 10 21.410±3.04二甲雙胍組 11 17.135±4.31中藥高劑量組 12 12.540±3.67#中藥低劑量組 11 15.450±4.57#

2.3 當(dāng)歸四逆湯對(duì)DPN大鼠NF-κb 蛋白表達(dá)影響 通過免疫組化顯示，DPN模型組與中藥組對(duì)DPN大鼠蛋白表達(dá)明顯高于正常組（P＜0.01），當(dāng)歸四逆湯高劑量組、低劑量組與二甲雙胍組DPN大鼠蛋白表達(dá)均降低，治療組與模型組相比差異具有顯著性（P＜0.05）。治療組之間差異無顯著性（P＞0. 05），見表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)歸四逆湯可降低NF-κb蛋白表達(dá)，抑制相關(guān)炎癥反應(yīng)，發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)效應(yīng)。

表2 各組坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度比較（x±s）

表3 各組NF-κb蛋白表達(dá)水平

2.4 當(dāng)歸四逆湯對(duì)DPN大鼠NF-κb mRNA表達(dá)影響 模型組與空白組比較，大鼠坐骨神經(jīng)mRNA相對(duì)表達(dá)量提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng)歸四逆湯組、二甲雙胍組與模型組比較，結(jié)果顯示NF-κb mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），經(jīng)比較，當(dāng)歸四逆湯高劑量組效果最為顯著，見表4。

表4 各組坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)NF-κb mRNA的表達(dá)量（x±s）

3 討論

我國(guó)糖尿病患病人數(shù)較多，DPN作為最常見的并發(fā)癥之一，病情遷延難愈，給人們生活帶來了嚴(yán)重的困擾。因此，有效預(yù)防、治療糖尿病及其并發(fā)癥的藥物研究成為當(dāng)今熱點(diǎn)。相關(guān)研究[9-10]表明，中藥可預(yù)防、治療糖尿病及其并發(fā)癥，且療效顯著。課題組在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究該通路下游NF-κB信號(hào)通路在當(dāng)歸四逆湯防治DPN中的作用。

NF-κb與DPN發(fā)生的病理、生理機(jī)制密切相關(guān)，在病理性疼痛發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，各種類型的大鼠末梢神經(jīng)損傷模型神經(jīng)元中都可見NF-κb的激活。NF-κb在正常狀態(tài)下，是以未激活形式存在于細(xì)胞漿中，一旦受到刺激就會(huì)從細(xì)胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，通過活化下游炎癥因子相關(guān)基因的表達(dá)，引起神經(jīng)細(xì)胞損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)歸四逆湯高劑量、低劑量組與模型組相比，NF-κb的蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯降低，坐骨神經(jīng)病理結(jié)果顯示當(dāng)歸四逆湯對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，提示當(dāng)歸四逆湯可能通過下調(diào)坐骨神經(jīng)NF-κb的表達(dá)，降低細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)的釋放，發(fā)揮對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變的治療作用。