雙特異性溶瘤腺病毒通過調節活性氧引起人肺癌細胞凋亡

白 冰，張冬娜，蔣本春，房金波，馬藝珍，朱羿龍，朱光澤，李 霄，金寧一

（長春中醫藥大學吉林省院士工作站，長春 130117）

肺癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，其發病率與死亡率在過去幾十年間迅速增長，已成為我國城市人口惡性腫瘤死亡原因的第一位。非小細胞肺癌包括腺癌、大細胞癌，鱗狀細胞癌，與小細胞肺癌相比具有癌細胞生長分裂速度慢，擴散轉移晚等特點。非小細胞肺癌發生率約占所有類型肺癌的80～85%，約75%的患者發現時已處于中晚期，五年生存率極低[1]。肺癌占所有男性癌癥的18%，占全部女性癌癥的7%。

近十年來，世界各國已經應用多種溶瘤腺病毒在Ⅰ期和Ⅱ期臨床實驗中對數百位患者進行治療，而且中國已經率先批準了溶瘤腺病毒用于腫瘤治療，美國和歐洲目前也在進行有關溶瘤腺病毒的Ⅲ期臨床試驗[2]。Onyx-015是由美國Onyx公司開發的一種能夠在腫瘤細胞中特異性復制并裂解腫瘤細胞的腺病毒藥物。Onyx-015可與化療聯合運用于腫瘤治療，具有良好的療效。研究表明，溶瘤腺病毒對對肺癌[3]、膀胱癌[4]、前列腺癌[5]、乳腺癌[6]、胃癌[7]等多種腫瘤細胞均有顯著性抑制作用。本研究所采用的基于腫瘤特異性啟動子hTERTp、病毒復制必須基因E1A和凋亡素基因Apoptin通過RAPAd.I腺病毒載體系統構建而成的溶瘤腺病毒ATV是由李霄[8]等構建，具有腫瘤特異性殺傷和腫瘤特異性復制能力的雙特異性溶瘤腺病毒。ATV通過誘導腫瘤細胞凋亡抑制腫瘤細胞增殖，ATV誘導人宮頸癌細胞及人肺癌細胞凋亡的凋亡率分別可達到（45.315±5.013）%[9]和（73.96±2.31）%[10]。本研究通過CCK-8檢測、Hoechst染色、Annexin V-FITC/PI流式細胞術、胞漿活性氧檢測一系列體外實驗驗證雙特異性溶瘤腺病毒可通過調節活性氧水平引起人肺癌細胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒與主要試劑 雙特異性溶瘤腺病毒（ATV）由本實驗室構建并保存，人肺癌細胞A549由本實驗室凍存。0.25%胰酶，胎牛血清購自BI公司；F12培養液購自Hyclone公司；CCK-8檢測試劑盒購自東仁化學科技有限公司；Hoechst染料購自美國Lf i e公司，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自BD公司；人活性氧（ROS）ELISA試劑盒購自默沙克生物科技公司。

1.2 CCK-8檢測法檢測A549細胞增殖 將處于對數生長期的A549細胞以5×103個/孔密度培養于96孔板中，于37 ℃，5% CO2培養箱中培養24 h，用1、10、50 moi兩種重組腺病毒ATV和Ad-Mock感染A549細胞，繼續培養12、24、48、72 h，每孔加入10 μL CCK-8，于37 ℃，5% CO2培養箱中孵育2 h，用酶標儀在450 nm測定各孔OD值，通過公式計算ATV對兩種細胞抑制率，確定最佳感染劑量。

1.3 Hoechst染色法檢測A549細胞的凋亡情況 將處于對數生長期的A549細胞以4×105個/孔密度培養于6孔板中，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，用50 moi的兩種重組腺病毒ATV和Ad-Mock分別感染兩種細胞，于培養箱中繼續培養12、24、48、72 h，每孔加入稀釋后的Hoechst 100 μL，避光孵育15 min，倒置在熒光顯微鏡下拍照并分析結果。

1.4 Annexin V-FITC/PI流式法檢測ATV誘導A549細胞凋亡率 將處于對數生長期的A549細胞以2.5×105個/孔密度培養于6孔板中，于37 ℃，5%CO2培養箱中培養24 h，用50 moi兩種重組腺病毒ATV和Ad-Mock感染A549細胞，于培養箱中繼續培養12、24、48、72 h，向細胞中加入Annexin V-FITC和PI，避光孵育20 min，利用FACS流式細胞儀進行檢測并分析結果。

1.5 胞漿活性氧檢測 將處于對數生長期的A549細胞以5×103個/孔密度培養于96孔板中，于37 ℃，5%CO2培養箱中培養24 h，用50 moi兩種重組腺病毒ATV和Ad-Mock感染A549細胞，于12、24、48、72 h用活性氧檢測試劑盒中的樣品稀釋液將細胞吹下，超聲破碎3 000 r/min離心10 min，取上清為待檢樣品。參照說明書將樣品稀釋液 48 μL，及上述各待測樣品 2 μL加于酶標板孔底部，晃動混勻。置 37 ℃溫箱中溫育 30 min，加入洗滌液洗滌五次，拍干。除空白孔外每孔加入酶標試劑 50 μL，依照以上步驟再溫育和洗滌一次。每孔先加入顯色劑 A 50 μL，再加入顯色劑 B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL，用酶標儀在450 nm測定各孔OD值。

1.6 統計方式 采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據統計，并且以均數±標準差（± s ）表示，組間比較均采用t檢驗，規定P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CCK-8法檢測ATV對A549細胞增殖的抑制作用 CCK-8檢測結果表明，ATV對A549細胞具有明顯抑制作用，且該作用具有時效與劑效關系，而Ad-Mock對A549細胞無明顯抑制作用。如圖1所示，ATV在12、24、48、72 h對A549細胞均具有不同程度的抑制作用，且抑制率隨時間的增長而增強；劑量分別為1 moi、10 moi、50 moi的ATV對A549細胞均具有不同程度的抑制作用，且抑制率隨劑量的增加而增強，感染劑量為1 moi時，ATV對A549細胞的抑制作用隨時間的增長無明顯變化（P＞0.05）且在各個時間點，ATV與Ad-Mock對A549細胞的抑制作用均無明顯差異（P＞0.05），感染劑量為10 moi和50 moi時，ATV對A549細胞抑制作用隨時間的增長顯著增強（P＜0.05）且ATV與Ad-Mock對A549細胞的抑制作用在48與72 h存在顯著性差異（P＜0.05），由該結果可得出結論：50 moi為ATV的最佳感染劑量。

圖1 CCK-8法檢測ATV對A549細胞的抑制率

2.2 Hoechst法檢測ATV對A549細胞的抑制方式 Hoechst能夠與細胞DNA結合，經紫外光激發后發出藍色熒光。在熒光顯微鏡下觀察到感染50moi ATV與Ad-Mock后的A549細胞如圖2所示，ATV感染后的A549細胞，48、72 h均有部分細胞呈核碎裂典型的濃染和邊集現象，隨著時間的增長，該現象更加明顯；而Ad-Mock感染后的A549細胞呈現均一的藍色熒光。由該結果可知，ATV能夠引起A549細胞凋亡。

2.3 Annexin V-FITC/PI流式法檢測ATV對A549細胞抑制途徑 通過Annexin V-FITC/PI流式檢測，如圖3所示，表明ATV可誘導A549細胞凋亡，且凋亡率隨時間的增長而增大，具有時間效應，而Ad-Mock對A549細胞凋亡無明顯影響。在48與72 h，A549細胞的凋亡率分別為50.54%和75.30%，ATV與Ad-Mock對A549細胞的凋亡率存在顯著性差異（P＜0.05），該結果表明ATV可引起A549細胞凋亡。

2.4 胞漿活性氧水平檢測結果 胞漿活性氧檢測結果如圖4所示，ATV感染A549細胞12、24、48、72 h，細胞活性氧水平隨時間的增長而提高，具有時間效應，而Ad-Mock組和A549細胞對照組細胞活性氧水平隨時間的增長無明顯變化（P＞0.05），在48 h與72 h，ATV感染的A549細胞中活性氧水平顯著高于Ad-Mock組和A549細胞對照組（P＜0.05），A549細胞凋亡率隨A549細胞中活性氧含量的增加而提高，該結果表明ATV可通過調節A549細胞中活性氧水平引起A549細胞凋亡。

3 討論

圖2 Hoechst 染色檢測ATV對A549細胞抑制方式（400×）

圖3 Annexin V-FITC/PI流式檢測ATV對A549細胞抑制途徑

圖4 A549細胞胞漿活性氧水平

活性氧（ROS）是細胞新陳代謝過程中產生的帶有未成對電子的原子、原子團或分子，具有穩定性極低、易分解等特點。包括過氧化氫、超氧陰離子、一氧化氮自由基及羥基自由基等[11]。ROS主要儲存在線粒體和還原性輔酶Ⅱ等氧化酶類中，其中線粒體是ROS產生最重要的場所。約有90%的ROS在線粒體氧化磷酸化產生ATP的過程，由分子氧經線粒體內膜呼吸鏈復合體Ⅰ及復合體Ⅲ傳遞產生。ROS作為信號分子能引起腫瘤細胞自噬、凋亡、耐藥及增殖抑制。ROS介導的凋亡途徑包括：通過增加線粒體膜通透性轉運孔開放，使細胞色素C釋放，激活半脫氨酸蛋白酶，活化caspases-9，并形成凋亡小體及多種蛋白復合物，進而活化下游 caspase-3，放大死亡信號，誘導細胞凋亡[12-14]。也可以通過泛素化使 caspase-8 蛋白的表達減少從而誘導凋亡。ROS也可以通過激活p53從而調節Wnt/β -catenin途徑及介導 NF-κB從而引起凋亡。

在雷公藤紅素作用腫瘤細胞的過程中，陳國柱等[15]、張志強等[16]研究發現雷公藤紅素對非小細胞肺癌細胞株 H1299 的殺傷作用與細胞內 ROS 的蓄積和 NF-κB通路的活性抑制有關。另外一些研究表明雷公藤紅素還可以通過 ROS/JNK 通路誘導人膠質母細胞瘤細胞[17]、骨肉瘤細胞[18]等的凋亡。此外，ROS 也與腫瘤耐藥性有關，誘導 ROS 產生可以增加腫瘤細胞對藥物的敏感性從而誘導腫瘤細胞的凋亡[19]。β-胡蘿卜素作用于食管鱗癌細胞后，能夠引起細胞內ROS含量增加，降低線粒體膜電位，觸發細胞色素C 的釋放，從而誘導凋亡蛋白 Bax 表達降低，蛋白Bcl-2、Casepase-3 表達增加，促使食管鱗癌細胞發生凋亡，證明β-胡蘿卜素能夠通過調節ROS水平促進食管鱗癌細胞凋亡從而對其起到抑制作用[19]。青蒿琥酯可以誘導人肝癌細胞產生活性氧，活性氧引起 Bcl-2 水平下調以及 Bax 水平上調，使線粒體通透性增加、膜電位喪失，釋放細胞色素C，激發典型的線粒體凋亡通路，從而誘導肝癌細胞凋亡從而對其起到了抑制作用[20]。

本研究通過CCK-8明確了ATV能夠顯著性抑制A549細胞的增殖，通過Hoechst和Annexin V-FITC/PI流式確定了ATV能夠導致A549細胞凋亡，表明了ATV主要通過誘導A549細胞凋亡的方式來抑制A549細胞的增殖。通過檢測A549細胞內胞漿活性氧水平，明確了ATV誘導A549細胞的凋亡與胞內活性氧含量的關系，即A549細胞的凋亡率隨細胞中活性氧含量增加而升高，驗證了雙特異性溶瘤腺病毒ATV可通過調節活性氧水平引起人肺癌細胞A549細胞凋亡。