硫酸銅和納米銅對雞胚代謝和發育的影響

郭永清，張小宇，陳玉潔，王 勇，楊 鳳

（1.內蒙古農業大學職業技術學院，內蒙古包頭 014109；2.內蒙古農業大學，內蒙古呼和浩特 010018）

銅是酶- 輔酶催化反應、氧轉運和血紅蛋白合成等生化過程所需的微量礦物質元素（Kim 等，2008），同時它用于家禽具有促生長和抗病作用（Richards 等，2010）。家禽養殖中，銅常作為替代抗生素的首選微量元素，對家禽生長性能的影響可以達到與抗生素一致的效果。理論上，日糧添加越多的銅其促生長效果越好，但實際日糧銅水平升高會導致家禽和豬的消化率降低，過多的銅經糞便排出，對環境造成污染（Zhao 等，2010）。有學者認為，無機銅較有機銅或納米銅的生物學效率低，但關于有機銅對家禽生長或免疫方面的研究結果存在差異（Creech 等，2004），還有待進一步探討。雞整個生命周期中有近40% 的時間是在胚胎中度過，因此，胚胎發生期是雞生長過程中最關鍵的時期（Azaranova 等，2012）。Yair 和Uni（2011）認為胚胎在孵化的最后幾天，蛋黃中銅含量低會導致胚胎缺乏礦物質，在此期間，胚胎可利用的銅較少；因此，體外給胚胎提高銅理論上可以提高雞蛋的孵化性能和仔雞生長性能。有研究表明，給雞胚體外注射納米銅較硫酸銅更能滲透進入胚胎組織，從而可以提高生長性能，同時體外注射納米銅也對胚胎無毒害作用，對出生仔雞的死亡率也無顯著影響（Joshua 等，2016）。納米銅可以在細胞和核膜之間移動，穿透細胞和細胞內結構，移動到體內指定的目標點。有研究表明，50 mg/kg 納米銅可以在分子和系統水平上增強胚胎血管敏感性，因此，本試驗通過體外注射納米銅和硫酸銅，研究其對雞胚代謝的影響，其中耗氧量和能量消耗量是重點考察指標，它們是評估胚胎代謝率的重要指標（Tona 等，2004）。

1 材料與方法

1.1 試驗設計 試驗選擇240 枚SPF 受精蛋，隨機分為6 組，每組4 個重復，每個重復10 枚雞蛋。雞蛋入孵當天對照組不做任何處理，陰性對照組注射0.25 mL 去離子水，硫酸銅組分別注射0.25、50 和100 mg/kg 硫酸銅，納米銅組分別注射0.25、50 和100 mg/kg 納 米 銅（5 ～10 nm，99% 純 度，購自四川吉隆達集團），即每個雞蛋注射12.5 或25 μg 硫酸銅或納米銅。受精蛋注射硫酸銅或納米銅后，將蛋放入孵化箱孵化21 d，其中1 ～18 d 孵化溫度為37.8℃，相對濕度為60%，每天翻蛋1 次；19 ～21 d 孵化溫度為37℃，相對濕度為70%。

1.2 胚胎代謝 分別在孵化的第12、14、16 和18天進行代謝測定，具體測定方法參考Chwalibog等（2007）的方法，其中氧耗量通過氧交換機進行測定，由于雞蛋重量存在差異，因此，統一化成50 g雞蛋的耗氧量。計算公式如下：

1.3 血液指標及組織器官重量 在孵化結束當天，每個重復隨機選擇5 只雞稱重后采血，頸部處死。血液離心后分離血清，用試劑盒法測定血清白蛋白、堿性磷酸酶、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、乳酸脫氫酶、膽固醇、肌酸苷、甘油三酯、磷酸鹽、尿素氮和葡萄糖含量（試劑盒購自南京建成生物工程研究所）。仔雞出殼后稱量卵黃囊重，分離屠宰雞的心臟、肝臟、小腸和胸肌，稱其重量

1.4 基因表達 將肝臟組織和胸肌組織在液氮條件下磨碎，用Trizol 法提取總RNA，參考Sawosz 等（2012）的研究方法，其中肝臟組織分析核因子和腫瘤壞死因子α 基因的相對表達量，胸肌組織分析血管內皮生長因子A 和成纖維細胞生長因子2 基因的相對表達量。熒光定量PCR 結果均以β-actin 基因作為內參。

1.5 統計分析 試驗數據采用SAS 一般線性模型進行分析，用Ducan’s 法進行多重比較。其中耗氧量和能量消耗量的差異采用LSD 法，具體模型為Yij=u+ai+bj+（ab）ij+eij，其中u 表示試驗數據平均值，ai表示各處理組效應，bj表示孵化天數，（ab）ij表示組別和日齡的交互效應，eij表示殘差。以P ＜0.05 作為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 雞胚注射不同水平硫酸銅和納米銅對雞胚代謝速度的影響 由表1 可知，與對照組和陰性對照組相比，雞胚注射硫酸銅和納米銅提高了雞胚耗氧量。雞胚注射50 mg/kg 納米銅較其他組顯著提高了16 和18 d 雞胚耗氧量（P ＜0.05），而100 mg/kg 硫酸銅較50 mg/kg 硫酸銅組顯著提高了12 和14 d 雞胚耗氧量（P ＜0.05），同時100 mg/kg 納米銅較50 mg/kg 納米銅顯著提高了各日齡雞胚的耗氧量（P ＜0.05）。雞胚注射硫酸銅或納米銅對雞胚孵化全期耗氧量無顯著影響（P ＞0.05）。

表1 硫酸銅和納米銅對雞胚耗氧量的影響 mL/h

雞胚注射不同水平硫酸銅和納米銅對雞胚能量消耗量的影響見表2，雞胚注射硫酸銅或納米銅較對照組和陰性對照組顯著提高了各日齡雞胚能量消耗（P ＜0.05）。除了18 d 雞胚外，100 mg/kg 硫酸銅較50 mg/kg 硫酸銅均顯著提高了雞胚能量消耗（P ＜0.05）。50 mg/kg 納米銅較100 mg/kg 納米銅顯著提高了12 d 雞胚能量消耗（P ＜0.05），但在后期各階段均顯著低于100 mg/kg 納米銅（P ＜0.05）。雞胚注射硫酸銅或納米銅對雞胚孵化全期能量消耗無顯著影響（P ＞0.05）。

表2 硫酸銅和納米銅對雞胚能量消耗的影響

2.2 雞胚注射不同水平硫酸銅和納米銅對血液生化指標的影響 由表3 可知，各組對雞胚血液生化指標的影響無顯著差異（P ＞0.05）。但納米銅組較對照組、陰性對照組和硫酸銅組有降低雞胚血液膽固醇和甘油三酯含量的趨勢（P=0.07）。

2.3 雞胚注射不同水平硫酸銅和納米銅對雞胚組織器官相對重量的影響 由表4 可知，與對照組和陰性對照組相比，雞胚注射納米銅或硫酸銅對雞胚蛋黃、心臟、肝臟、小腸和胸肌重量的影響均無顯著差異（P ＞0.05）。雞胚注射硫酸銅、納米銅或去離子水較對照組顯著提高了卵黃囊重量（P ＜0.05），納米銅組和陰性對照組較硫酸銅組顯著提高了卵黃囊重量（P ＜0.05），和100 mg/kg納米銅組相比，50 mg/kg 納米銅卵黃囊重量顯著提高4.3%（P ＜0.05），而50 和100 mg/kg 硫酸銅對雞胚卵黃囊重量的影響無顯著差異（P ＞0.05）。

表3 硫酸銅和納米銅對雞胚血液生化指標的影響

表4 硫酸銅和納米銅對雞胚組織器官重量的影響 g

2.4 雞胚注射不同水平硫酸銅和納米銅對雞胚發育相關基因表達的影響 由表5 可知，與對照組和陰性對照組相比，雞胚注射納米銅或硫酸銅對雞胚核因子、腫瘤壞死因子α 和血管內皮生長因子A 基因的mRNA 相對表達水平均無顯著影響（P ＞0.05）。但100 mg/kg 硫酸銅組較其他各組顯著提高了成纖維細胞生長因子2 基因的mRNA 相對表達水平（P ＜0.05）。

3 討論

銅經過納米級處理后對動物生長性能影響的機制還尚不清楚，有研究認為，納米銅可以提高機體的抗菌能力，但也有報道指出，納米銅主要是通過改善機體對能量和脂肪的消化率來影響生長 性 能（Usman 等，2013）。Pineda 等（2012）研究發現，納米級的銀離子可以運輸氧氣，而納米銅是輸氧蛋白的主要成分，因此，作者假設雞胚體外注射納米銅可以提高氧氣的利用率。銅是血紅蛋白的重要組成部分，負責細胞氧氣的運輸和一些重要酶如細胞色素c 氧化酶的活力，后者對細胞能量代謝極為重要。本試驗研究了體外注射納米銅或硫酸銅對雞胚耗氧量和能量消耗量的影響。結果發現，雞胚注射硫酸銅或納米銅較對照組和陰性對照組顯著提高了各日齡雞胚能量消耗，且納米銅的效果更為顯著，這與納米銅較硫酸銅的生物學利用率高，對血管形成和生長的作用高于硫酸銅有關（Mroczek-Sosnowska 等，2015）。此外，納米銅由于顆粒粒度小，具有較高的表面積，因此具有特殊的物理化學活性和較強的穿透能力（Mamonova 等，2013）。

表5 硫酸銅和納米銅對雞胚發育相關基因表達的影響

試驗用卵黃囊和組織器官的重量評估胚胎的發育狀況，但結果發現，雞胚注射硫酸銅、納米銅或去離子水較對照組顯著提高卵黃囊重量，但對其他組織器官的重量無顯著影響，這說明硫酸銅或納米銅對雞胚代謝率的影響還未達到影響雞胚生長發育的程度。50 mg/kg 納米銅提高了雞胚代謝率，這與Pineda 等（2012）的研究報道存在差異，這與不同品種的雞胚重量不同有關，蛋雞雞胚重量小于肉雞，代謝速度慢。肉雞生長快速，其蛋黃較大，需要更多的能量用于生長（Buzala 等，2015）。

本試驗結果發現，體外注射硫酸銅或納米銅對血清生化指標無顯著影響，納米銅較硫酸銅有降低甘油三酯和膽固醇的趨勢，說明雞胚孵化前注射硫酸銅對雞胚孵化性能無顯著影響Mroczek-Sosnowska 等（2015）。雞胚注射硫酸銅或納米銅對肝臟免疫相關基因（核因子和腫瘤壞死因子）及胸肌生長相關基因（血管內皮生長因子A）的mRNA 相對表達量無顯著影響，但100 mg/kg硫酸銅組較其他各組顯著提高了成纖維細胞生長因子2 基因的mRNA 相對表達水平，其原因可能是抗原呈遞細胞沒有在孵化的幼體中吸收納米銅離子，并且免疫刺激功能還不完善，同時Pineda等（2012）的研究結果也顯示雞胚注射50 mg/kg納米銅對抗炎因子也無顯著影響。

4 結論

雞胚體外注射50 mg/kg 納米銅可以促進胚胎代謝速度，納米銅對雞胚具有免疫生物學相容性，對雞胚孵化無負面影響。