茯苓甘草湯對功能性消化不良大鼠的調節作用

曹 峰， 羅振亮， 秦 源， 丁 然， 唐阿梅， 劉 楊

（貴陽中醫學院， 貴州 貴陽550025）

功能性消化不良是一種常見的消化系統疾病， 患者胃部并無明顯器質性病變， 但有腹部疼痛或不適、 飽脹、 噯氣不舒、 嘔逆等臨床癥狀， 而且胃腸動力明顯不足， 進食減少， 其發病原因和機制復雜不明。 《傷寒論》 中茯苓甘草湯功效溫胃化飲、 通陽利水， 主治心下悸、 四肢不溫、胃中痞滿、 漉漉有水聲、 舌淡苔滑， 這與功能性消化不良之中醫證候的胃虛飲停證較相似。 課題組前期發現， 茯苓甘草湯對功能性消化不良大鼠乙酰膽堿酯酶活性有激活作用［1］， 故本實驗以此為基礎， 進一步考察該方針對功能性消化不良改善作用的潛在靶點。

1 材料

1.1 藥物 茯苓甘草湯中的茯苓、 桂枝、 甘草、 生姜購自貴州同濟堂藥業有限公司， 經貴陽中醫學院董麗莎教授鑒定為正品。 按《傷寒論》 原方， 取茯苓2 兩（30 g）、 桂枝2兩（30 g）、 炙甘草1 兩（15 g）、 生姜3 兩（45 g）， 配伍后打粉， 過100 目篩， 10 倍蒸餾水煎煮1 次， 8 倍蒸餾水煎煮2 次， 過濾后合并濾液， 60 ℃下緩慢蒸發至所需濃度溶液后保存備用（每1 mL 相當于原方劑藥材量1 g）。 多潘立酮片，批號170306533， 由西安楊森制藥有限公司提供。

1.2 動物 SD 大鼠， 雌雄各半， 體質量180～220 g， 由長沙天勤生物技術有限公司提供， 動物許可證號SCXK（湘） -2014-0011， SPF 級環境飼養， 室溫20～26 ℃， 實驗動物倫理委員會批準編號1509005， 動物飼料也由上述單位提供。

1.3 試劑 AQP4、 Leptin、 eNOS、 β-actin 抗 體， 貨 號ab9512、 ab117751、 ab76198、 ab8227， 由英國Abcam 公司提 供； ZO-2、 YAP、 CGRP 抗 體， 貨 號 2847、 4912、14959， 由美國CST 公司提供； 山羊抗兔HRG 抗體， 批號109525， 由北京中杉金橋生物技術有限公司提供。 SDSPAGE 凝膠制備試劑盒， 貨號G1120； BCA 蛋白濃度定量試劑盒， 貨號PC0020； ECL 發光劑， 貨號PE0010， 由北京索萊寶生物科技有限公司提供。

1.4 儀器 電子數顯游標卡尺， 由上海美耐特五金工具公司提供； KD-202A 石蠟切片機， 由浙江科迪儀器設備有限公司提供； CX21 型光學顯微鏡， 由日本Olympus 公司提供。

2 方法

2.1 分組及給藥 60 只大鼠隨機分為空白組、 模型組、茯苓 甘 草 湯 組 （ 20、 10、 5 g／kg）、 多 潘 立 酮 組（0.004 g／kg）， 每組10 只， 空白組大鼠灌胃給予常溫生理鹽水， 其余各組大鼠給予0 ℃、 0.5 mol／L 稀鹽酸誘導功能性消化不良模型［1］。 14 d 后， 正常組、 模型組大鼠給予常溫生理鹽水， 其余各組大鼠給予常溫相應濃度藥物， 每天灌胃給藥1 次， 連續7 d， 末次給藥1 h 后， 檢測各組大鼠腸推進功能， 并取胃組織置于4%多聚甲醛中， -80 ℃下保存備用。

2.2 大鼠腸推進功能測定 各組大鼠末次給藥前禁食8 h后， 給予半流質飼料和碳粉混合物， 2 g／只， 10 min 后藥物干預， 30 min 后取小腸平鋪， 測量半流質飼料和碳粉混合物從幽門括約肌推動到回盲部的距離， 進行記錄和統計分析。

2.3 大鼠胃組織AQP4、 Leptin、 eNOS 蛋白表達檢測 采

用免疫組化法。 大鼠胃組織用自來水沖洗4 h， 不同體積分數乙醇（由低到高） 各脫水1 h， 二甲苯透明2 次， 每次20 min， 液體石蠟中浸泡2 次， 每次1.5 h， 包埋； 切片機上切片， 常規二甲苯脫蠟2 次， 每次15 min， 不同體積分數乙醇（由高到低） 水化， PBS 浸泡后3% 過氧化氫封閉10 min 以阻斷內源性過氧化物酶， PBS 沖洗后滴加Ⅰ抗，4 ℃孵育后滴加Ⅱ抗， DAB 顯影后， 自來水沖洗， 復染，脫水， 透明， 封片。

2.4 大鼠胃組織ZO-2、 YAP、 CGRP 蛋白表達檢測 采用蛋白印跡法。 BCA 蛋白定量試劑盒蛋白定量后， SDS-PAGE凝膠制備試劑盒制備12% 分離膠和5% 濃縮膠， 上樣后電泳1 h， 轉膜2 h， 5%脫脂奶粉封閉2 h 后加Ⅰ抗， 其中內參Ⅰ抗1 ∶8 000、 其他Ⅰ抗1 ∶3 000， TBST 沖洗3 次， 加入Ⅱ抗1 ∶7 000， TBST 沖洗3 次， ECL 發光液顯影。

2.5 統計學分析 通過SPSS17.0 軟件進行處理， 數據以（±s）表示， 組間比較采用非參數秩和檢驗。 以P＜0.05 為差異有統計學差異。

3 結果

3.1 茯苓甘草湯對大鼠腸推進功能的影響 與空白組比較， 模型組大鼠腸功能推進距離顯著縮短（P＜0.01）； 與模型組比較， 茯苓甘草湯20、 10 g／kg 組其距離顯著增加（P＜0.01）。 見表1。

表1 茯苓甘草湯對大鼠腸推進功能的影響（±s， n＝8）

表1 茯苓甘草湯對大鼠腸推進功能的影響（±s， n＝8）

注：與空白組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1）腸功能推進距離／mm空白組 — 23.53±5.58??模型組 — 15.71±2.57＃＃茯苓甘草湯組 20 23.06±4.21??茯苓甘草湯組 10 21.86±3.88??茯苓甘草湯組 5 19.96±5.91多潘立酮組 0.004 23.16±3.94??

3.2 茯苓甘草湯對大鼠胃組織AQP4、 Leptin、 eNOS 蛋白表達的影響 AQP4、 Leptin、 eNOS 蛋白大多表達于胃黏膜腺泡內（圖1～3）； 與模型組比較， 茯苓甘草湯各劑量組AQP4 蛋白表達顯著升高（P＜0.05， P＜0.01）， Leptin 蛋白表達顯著降低（P＜0.05）， 并且20、 10 g／kg 組eNOS 蛋白表達也顯著降低（P＜0.05， P＜0.01）。 見表2 （以光密度表示）。

圖1 茯苓甘草湯對大鼠胃組織AQP4 蛋白表達的影響（×400）

圖2 茯苓甘草湯對大鼠胃組織Leptin 蛋白表達的影響（×400）

圖3 茯苓甘草湯對大鼠胃組織eNOS 蛋白表達的影響（×400）

表2 茯苓甘草湯對大鼠胃組織AQP4、 Leptin、 eNOS 蛋白表達的影響（±s， n＝5）

表2 茯苓甘草湯對大鼠胃組織AQP4、 Leptin、 eNOS 蛋白表達的影響（±s， n＝5）

注：與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1）AQP4 Leptin eNOS空白組 - 0.59±0.20?? 0.41±0.14? 0.33±0.14?模型組 - 0.32±0.11 0.61±0.13 0.57±0.21茯苓甘草湯組 20 0.57±0.17?? 0.42±0.20? 0.33±0.13?茯苓甘草湯組 10 0.57±0.27? 0.38±0.22? 0.32±0.11??茯苓甘草湯組 5 0.54±0.22? 0.40±0.21? 0.47±0.23多潘立酮組 0.004 0.47±0.17 0.49±0.07 0.41±0.16

3.3 茯苓甘草湯對大鼠胃組織ZO-2、 YAP、 CGRP 蛋白表達的影響 與模型組比較， 茯苓甘草湯各劑量組ZO-2 蛋白表達上調， 以10 g／kg 組更顯著（P＜0.05）； 各劑量組YAP蛋白表達顯著下調（P＜0.05， P＜0.01）； 各劑量組CGRP蛋白表達下調， 以20、 10 g／kg 組更顯著（P＜0.05， P ＜0.01）。 見圖4、 表3 （以光密度表示）。

4 討論

圖4 茯苓甘草湯對大鼠胃組織ZO-2、 YAP、 CGRP蛋白表達的影響

表3 茯苓甘草湯對大鼠胃組織ZO-2、 YAP、 CGRP 蛋白表達的影響（±s， n＝5）

表3 茯苓甘草湯對大鼠胃組織ZO-2、 YAP、 CGRP 蛋白表達的影響（±s， n＝5）

注：與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1）ZO-2／β-actin YAP／β-actin CGRP／β-actin空白組 — 0.22±0.05? 0.29±0.16?? 0.07±0.03?模型組 — 0.09±0.01 0.80±0.05 0.15±0.03茯苓甘草湯組 20 0.22±0.07 0.44±0.17? 0.05±0.02??茯苓甘草湯組 10 0.42±0.10? 0.38±0.17?? 0.07±0.04?茯苓甘草湯組 5 0.32±0.21 0.51±0.19? 0.13±0.08多潘立酮組組 0.004 0.21±0.17 0.62±0.18 0.09±0.06

隨著社會發展、 生活壓力不斷增加， 功能性消化不良發病率逐年增加， 其誘因與腦腸軸失衡、 慢性炎癥、 內臟感覺異常、 幽門螺旋桿菌感染、 精神相關因素、 飲食生活失約等有密切聯系［2-3］。 AQP4 蛋白作為跨膜轉運蛋白， 廣泛分布于胃部上皮細胞層內， 對胃酸分泌、 水分轉運、 滲透壓調節起到重要作用［4］； 瘦素（leptin） 分布于胃主細胞和壁細胞內， 其分泌受到飲食及神經-激素調節影響， 可減少食物攝入、 分解脂肪促進機體能量代謝， 并可激活下游JAK、 PI3K 等信號通路參與胰島素分泌調節、 炎癥反應等病理過程［5］； 內皮型一氧化氮合酶（eNOS） 以L-精氨酸為底物合成NO， 參與血管舒縮調節、 抑制血小板凝集、 保護內皮細胞等［6］， 在消化系統中可能參與調節胃腸黏膜血流、 調節胃腸黏膜分泌功能以及保護胃腸黏膜， 目前普遍認為NO 增多會引起胃腸動力減弱； YAP 是Hippo 信號通路的下游蛋白， 有著調節器官發育、 誘發癌癥、 促進細胞增殖、 雙向調節細胞凋亡、 調節細胞密度和分布發生變化等作用［7-8］； ZO-2 是緊密連接蛋白家族成員之一， 存在于細胞緊密連接、 黏附連接和縫隙連接處， 在上皮細胞和內皮細胞間起著連接作用， 作為骨架蛋白， 它是胃腸黏膜屏障正常功能發揮和生理結構完整性的重要保護蛋白， 對維持水分子、 細胞大分子等物質進行細胞旁通透有重要意義，其異常表達會造成胃腸黏膜緊密連接功能異常和組織滲透壓失衡， 并可通過攜帶的PDZ 結構域在細胞核與細胞質之間自由穿梭， 與YAP 蛋白所攜帶的PDZ 結合序列相結合發揮生物學活性， 它既可促進YAP 蛋白進入細胞核激活其活性， 又可將其滯留在細胞質中抑制活性的發揮； 降鈣素基因相關肽（CGRP） 是與痛覺調控相關的神經活性肽， 廣泛存在于胃腸道， 其分泌增高可引起胃黏膜血流量增加、減緩胃腸運動、 痛覺傳導異常敏感， 導致內臟高敏感性［9-10］。

本實驗發現， 茯苓甘草湯具有明顯的促進胃腸運動作用， 與多潘立酮功效相當， 甚至在一定程度上表現更好。給予茯苓甘草湯后， 可改善因稀鹽酸誘導消化不良造成的胃腸蠕動遲緩， 促進腸推進功能； 升高胃黏膜AQP4 蛋白表達， 增強胃內水液轉運； 降低胃內Leptin 高表達， 增強食欲提高胃腸蠕動； 降低胃黏膜eNOS 過表達， 減輕NO 過度生成， 增強胃腸動力； 上調ZO-2 蛋白表達， 促進組織或細胞間緊密連接； 抑制YAP 蛋白在胃內過表達， 減輕黏膜細胞過度增殖； 降低CGRP 蛋白過表達， 增強胃腸蠕動，由此推測， 對這些蛋白的調節作用可能是該方改善功能性消化不良的潛在作用機制。