HPLC 法同時測定腫節風三清顆粒中2 種成分

陶 卿， 劉 磊， 唐廷崇， 吳文健， 何家康

（1. 廣西北斗星動物保健品有限公司， 廣西 南寧530001； 2. 廣西大學， 廣西 南寧530004）

腫節風為金粟蘭科植物草珊瑚Sarcandra glabra（Thunb.） Nakai 的干燥全草， 主產于四川、 福建、 廣西等地， 其味苦、 微辛， 性平， 歸心、 肝經， 具有清熱涼血、活血化瘀、 祛風通脈等功效， 用于血熱發斑發疹、 風濕痹痛、 跌打損傷［1-2］。 腫節風三清顆粒是將腫節風、 射干、 甘草按中獸醫理論組方制成的顆粒， 具有祛痰、 平喘、 止咳等功效， 臨床用于雞慢性支氣管炎等呼吸道疾病。 現行獸藥典［3］中收載了腫節風， 但僅檢測異嗪皮啶含有量， 而現有研究表明迷迭香酸具有抗菌、 抗血栓、 抗血小板聚集等生物活性， 與腫節風藥理作用和臨床適應癥相吻合［4-6］， 故為了提高產品質量， 準確檢測出產品中異嗪皮啶、 迷迭香酸含有量顯得尤為重要。 參考文獻［7-9］， 本實驗建立HPLC 法同時測定腫節風三清顆粒中異嗪皮啶、 迷迭香酸的含有量， 以期為該制劑質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AT 高效液相色譜儀， 配置SPD-20A 紫外檢測器、 SIL-20A 自動進樣器， 購于日本島津制作所；BP211D 電子分析天平， 購于德國賽多利斯公司； TU-1901紫外可見分光光度計， 購于北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 試藥 腫節風三清顆粒（批號20121001）， 由廣西北斗星動物保健品有限公司提供。 異嗪皮啶、 迷迭香酸對照品均購于中國食品藥品檢定研究院（批號110837-201206、11871-201102）。 腫節風、 射干、 甘草均購于南寧生源中藥飲 片 有 限 責 任 公 司 （ 批 號 20110501、 20110901、20110801）， 經廣西中醫藥大學藥用植物教研室銀勝高副教授鑒定為正品。 乙腈、 甲醇、 磷酸均為色譜純； 水為超純水。

2 方法

2.1 色譜條件 Phenomenex Luna C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）， 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑； 流動相乙腈（A） -0.1% 磷酸（B）， 梯度洗脫（0 ～5 min，10%A； 5～25 min， 10% ～18% A； 25 ～52 min， 18% ～25%A； 52～60 min， 25% ～100%A）； 體積流量1.0 mL／min； 檢測波長330 nm； 進樣量10 μL。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取對照品異嗪皮啶1.0 mg、迷迭香酸1.5 mg， 置于25 mL 量瓶中， 甲醇稀釋至刻度，搖勻， 即得（線性關系考察用）。 再精密稱取2 種對照品適量， 置于25 mL 量瓶中， 甲醇稀釋至刻度， 即得（兩者各含10 μg／mL， 加樣回收率試驗用）。

2.3 供試品溶液制備 精密稱取顆粒粉末1.0 g， 置于100 mL具塞錐形瓶中， 加入50 mL 甲醇， 水浴加熱回流1 h，放冷， 搖勻， 0.45 μm 微孔濾膜濾過， 取續濾液， 即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 按處方比例制備缺腫節風的陰性樣品， 按“2.3” 項下方法制備， 即得。

3 結果

3.1 專屬性試驗 取對照品、 供試品、 陰性樣品溶液， 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定， 結果見圖1。 由圖可知，異嗪皮啶、 迷迭香酸均與相鄰峰的分離度良好（＞1.5），陰性無干擾。

3.2 線性關系考察 精密量取對照品溶液1、 2、 3、 4、5 mL， 置于10 mL 量瓶中， 甲醇稀釋至刻度， 精密量取10 μL， 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定。 以溶液質量濃度為橫坐標（X）， 峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸， 得異嗪皮啶、 迷迭香酸回歸方程分別為Y ＝28 658.43X ＋8 264.565（r ＝0.999 7）、 Y ＝27 783.65X-11 532.53 （r ＝0.999 7）， 分別在3.795 ～18.975、 6.035 ～30.175 μg／mL范圍內線性關系良好。

3.3 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL， 在“2.1”項色譜條件下進樣測定6 次， 測得異嗪皮啶、 迷迭香酸峰面積RSD 分別為1.17%、 0.72%， 表明儀器精密度良好。

3.4 重復性試驗 精密稱取顆粒（批號20101201） 6 份，按“2.3” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定， 測得異嗪皮啶、 迷迭香酸含有量RSD 分別為1.2%、 1.15%， 表明該方法重復性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

3.5 穩定性試驗 精密稱取顆粒（批號20101201） 1.0 g，按“2.3” 項下方法制備供試品溶液， 于室溫下放置0、 2、4、 8、 12、 16、 24 h 后在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得異嗪皮啶、 迷迭香酸含有量RSD 分別為0.72%、0.71%， 表明溶液在24 h 內穩定性良好。

3.6 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的顆粒（批號20101201） 0.5 g， 平行6 份， 精密加入“2.2” 項下對照品溶液25 mL， 按“2.3” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定， 結果見表1。

3.7 樣品含有量測定 取3 批顆粒， 按“2.3” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.1” 項色譜條件下進樣10 μL 測定， 計算含有量， 結果見表2。

4 討論

查閱2015 年版《中國藥典》 一部發現， 腫節風含有量測定項下的檢測波長為342 nm， 為異嗪皮啶最大吸收， 而迷迭香酸最大吸收波長為330 nm。 本實驗發現， 在330 nm波長下2 種成分均有靈敏度高的較強吸收， 故選擇其作為檢測波長。

表1 各成分加樣回收率試驗結果（n＝6）

表2 各成分含有量測定結果（n＝3）

腫節風三清顆粒是由腫節風、 射干、 甘草3 味藥材經提取后加工制成， 成分較復雜。 前期曾按文獻［10-11］ 方法檢測異嗪皮啶、 迷迭香酸， 但雜質峰不能得到有效分離，本實驗通過查閱大量文獻結合《中國藥典》， 對色譜條件進行反復探索優化， 最終確定“2.1” 項下條件。 同時，還驗證該條件在不同品牌色譜柱、 柱溫下的分離效果， 發現室溫下各色譜柱均能將主峰與雜質峰有效分離， 而且峰形良好， 保留時間適中， 適用于該制劑含有量測定。

目前， 在人醫臨床上以腫節風的為主的藥物制劑已得到廣泛應用［12］， 有片劑、 口服液、 注射液等劑型， 其質量控制方法也較成熟， 而且研究人員對該藥材大部分有效成分進行提取分離， 還深入考察有效部位在體內的作用機制和代謝過程， 為臨床用藥提供依據。 然而， 在獸醫臨床上腫節風浸膏及制劑的標準均未收載于獸藥典， 表明其開發相對滯后。 本實驗建立HPLC 法同時測定腫節風三清顆粒中異嗪皮啶、 迷迭香酸的含有量， 以期能促進相關獸藥制劑標準的制訂， 并充分發揮腫節風在獸醫臨床上的疫病防治作用。