西紅花HPLC 指紋圖譜建立及成分分析

邢越陽， 高 崎， 張 雪， 司睿蓉， 吳佩穎，?

（1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)， 上海201203； 2. 上海上藥杏靈科技藥業(yè)股份有限公司， 上海201203； 3. 上海市藥材有限公司， 上海200002）

西紅花為鳶尾科植物番紅花Crocus sativus L.的干燥柱頭， 有活血化瘀、 涼血解毒、 解郁安神之功效， 《本草綱目》［1］對其功效表述為“心憂郁積，氣悶不散， 活血。 久服令人心喜。 又治驚悸”， 西紅花苷是西紅花主要活性成分， 在抗腫瘤、 治療心腦血管疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面有一定療效。現(xiàn)代藥理研究表明， 西紅花具有降血脂、 調(diào)節(jié)膽固醇［2-4］、 抗炎［5-6］、 抗氧化［7-8］、 改善記憶［9-10］、 抗腫瘤［11］等作用。

西紅花在食品、 醫(yī)藥、 美容等領(lǐng)域有重大應(yīng)用價值， 但其需求量巨大， 無法完全滿足市場需求。目前， 2015 版《中國藥典》 僅規(guī)定西紅花苷-I 和西紅花苷-II 總含有量不低于10.0%， 但中藥成分復(fù)雜， 單靠1、 2 種成分含有量來評價其質(zhì)量并不全面。 曾水云等［12］通過建立HPLC 指紋圖譜對不同產(chǎn)地西紅花進行比較， 共標定12 個共有峰， 通過分析各峰面積相對比值的差異來區(qū)別其來源； 本實驗采用該方法， 以期對該藥材進行更全面的質(zhì)量評價。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters Acquity ARC UHPLC 高效液相色譜儀、 Waters ACQUITY UPLCTMI-CLASS 超高效液相色譜儀、 Waters XevoG2-XS Q-TOF·ESI 液質(zhì)聯(lián)用儀（美國沃特世公司）； KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；Sartorius Quintx65-1CN 分析天平［十萬分之一， 賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］。

1.2 試藥 甲酸（分析純， 批號20141223， 上海豪申化學(xué)試劑有限公司）； 甲醇（色譜純， 批號175159， 德國Merck 公司）； 乙腈（色譜純， 批號175157， 德國Merck 公司）； 水為純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司， 批號201801053210BL06683）。西 紅 花 苷-Ⅰ （ 批 號 111588-201303， 含 有 量92.6%）、 西紅花苷-Ⅱ（批號111589-201304， 含有量92.4%） 對照品購自中國食品藥品檢定研究院。

建立對照指紋圖譜所需西紅花由上海市藥材有限公司西紅花事業(yè)部提供； 市售樣品經(jīng)網(wǎng)絡(luò)購物平臺按銷量排序， 選購排名前二十者， 經(jīng)上海市藥材有限公司裴衛(wèi)忠藥師鑒定為正品。 具體見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件 Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱 （4.6 mm × 100 mm， 2.7 μm）； 流 動 相［0.2%乙酸-乙腈（87 ∶13） ］ （A） -甲醇（B），梯度洗脫 （0 ～12 min， 0 ～35% B； 12 ～18 min，35% ～50% B； 18 ～26 min， 50% ～100% B； 26 ～28 min， 100%B）； 體積流量1.0 mL／min； 檢測波長254 nm； 柱溫35 ℃； 進樣量10 μL。

UPLC 液相方法同上， 洗脫梯度調(diào)整為0 ～30 min， 0～35%B； 30～45 min， 35% ～50%B； 45 ～65 min， 50% ～100%B； 65～70 min， 100%B， 進樣量2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）； 正離子檢測模式； 毛細管電壓3.0 kV； 錐孔電壓30 V；離子源溫度120 ℃； 去溶劑化溫度500 ℃； 去溶劑化氣體積流量800 L／h； 錐孔氣體積流量50 L／h；碰撞氣氬氣； 低碰撞能量通道5 eV； 高碰撞能量通道20 eV。

2.2 供試品溶液制備 精密稱取藥材粉末50.0 mg， 置棕色樣品瓶中， 精密加入50.0 mL 稀乙醇， 稱定質(zhì)量， 冰水浴超聲（200 W、 40 kHz）30 min， 取出， 放置室溫， 溶劑補足減失的質(zhì)量，搖勻， 過0.22 μm 微孔濾膜， 即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 重復(fù)性試驗 稱取同一藥材粉末5 份， 按“2.2” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣， 測得各共有峰相對峰面積RSD均小于2.87%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.2 精密度試驗 取藥材粉末， 按“2.2” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.1.1” 項色譜條件下連續(xù)進樣5 次， 測得各共有峰相對峰面積RSD均小于2.72%， 表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取藥材粉末， 按“2.2” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.1.1” 項色譜條件下于0、 2、 4、 8、 12 h 進樣， 測得各共有峰相對峰面積和相對保留時間RSD 均小于2.85%， 表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 HPLC 指紋圖譜建立 取“1.2” 項下10 批樣品， 按“2.2” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣， 色譜圖見圖1。 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件2012.130723 版進行分析， 在生成對照狀態(tài)下通過多點校正， 時間窗0.1 min， 平均數(shù)模式， 全譜峰匹配， 生成對照圖譜。 西紅花苷-I 作為西紅花中主要成分， 易于得到對照品， 含有量較高， 在指紋圖譜中的分離度良好， 因此選擇其作為參比峰， 共標定20 個共有峰，計算10 批藥材共有峰與參比峰的相對保留時間和相對峰面積， 結(jié)果見表2～3。

圖1 10 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of ten batches of samples

表2 10 批樣品共有峰相對保留時間Tab.2 Relative retention time of common peaks of ten batches of samples

表3 10 批樣品共有峰相對峰面積Tab.3 Relative peak areas of common peaks of ten batches of samples

2.5 相似度評價 20 種藥材按“2.2” 項下方法制備供試品溶液， 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣， 將結(jié)果與對照指紋圖譜比對， 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012.130723 版系統(tǒng)評價軟件計算相似度。結(jié)果， S1 ～S10 的相似度分別為0.997、 0.998、 0.998、 0.999、 0.996、 0.956、0.995、 0.999、 0.990、 0.988， A～T 的相似度分別 為 0.998、 0.998、 0.993、 0.996、 0.996、0.999、 0.998、 0.996、 0.998、 0.998、 0.995、0.997、 0.999、 0.995、 0.998、 0.995、 0.993、0.999、 0.996、 0.995， 均在0.9 以上， 表明藥材中各成分整體比例相近， 相似度較高， 差異較小。

2.6 成分標定 在“2.1” 項條件下進樣， 得色譜圖和正、 負離子模式下的總離子流圖， 分別記錄各色譜峰在HPLC、 UPLC 條件下的出峰時間， 以及以峰14 為參照的相對保留時間。結(jié)果見表4、圖2～3。

2.7 質(zhì)譜分析 根據(jù)正離子模式下各色譜峰的母離子及二級碎片信息， 通過與對照品比對指認了HPLC 指紋圖譜中的10 個主要色譜峰。

西紅花苷是一類由西紅花酸與不同數(shù)量葡萄糖形成的酯類化合物， 而糖苷鍵不穩(wěn)定， 易發(fā)生斷裂。 通 過 總 結(jié) 分 析 Carmona［13］、 Verma［14］、Lech［15］等對西紅花的研究， 發(fā)現(xiàn)在質(zhì)譜信號中常會出現(xiàn)西紅花酸與Na＋或H＋結(jié)合的分子離子峰m／z351.2 或329.2， 或不同數(shù)量葡萄糖基團與西紅花酸結(jié)合的質(zhì)譜碎片， 如m／z 513.2 為與單糖結(jié)合的分子離子峰、 m／z 675.2 為與雙糖結(jié)合的分子離子峰等， 由此推斷峰2～10 為西紅花苷類成分， 其中峰19、 20 在330 nm 波長處有較強吸收， 推測其可能為質(zhì)譜圖順式結(jié)構(gòu)。

表4 色譜峰相對保留時間Tab.4 Relative retention time of chromatographic peaks

峰14、 19 質(zhì)譜圖見圖4 ～5， 其準分子離子峰m／z 999.36， 為西紅花酸結(jié)合4 分子葡萄糖的西紅花苷類成分， 峰14 正離子模式下碎片離子峰m／z有511.180 8 ［M ＋2Na］2＋， 675.264 0 ［M-Gnt ＋Na］＋， 837.315 7 ［M-Glc ＋Na］＋， 329.174 9 ［M-2?Gnt ＋H］＋， 351.158 2 ［M-2 ?Gnt ＋Na］＋，347.094 8 ［Gnt＋Na］＋， 311.164 0 ［M-2?Gnt＋HH2O］＋； 峰19 在正離子模式下碎片離子峰m／z 與其類似， 兩者質(zhì)譜裂解規(guī)律也大致相同。 結(jié)合碎片離子峰， 推斷峰14 為西紅花苷-I （C44H64O24）， 根據(jù)對照品證實西紅花苷-I； 峰19 的保留時間較峰14 晚， 同時在330 nm 波長處有較強吸收， 根據(jù)文獻推斷為西紅花苷-I 的順式結(jié)構(gòu)cis-4-GG。

圖2 樣品UPLC-UV 色譜圖Fig.2 UPLC-UV chromatogram of samples

圖3 樣品總離子流色譜圖Fig.3 Total ion current chromatograms of samples

圖4 峰14 化合物質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectra of peak 14 compounds

圖5 峰19 化合物質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectra of peak 19 compounds

圖5 表明， 該化合物在254 nm 波長處有較強吸收， 結(jié)合其保留時間及文獻推斷為西紅花苦苷（C16H26O7）， m／z 353.156 8 ［M＋Na］＋是其母離子與一分子Na＋結(jié)合的分子離子峰， 質(zhì)譜碎片m／z 151.110 4 推斷為母離子脫掉葡萄糖基團的分子離子峰。 西紅花苷類成分裂解規(guī)律大致相同， 西紅花酸結(jié)合不同數(shù)目糖基團所形成苷類成分的準分子離子峰及碎片離子峰信息見表5。

表5 各成分LC-MS 分析Tab.5 LC-MS analysis of various constituents

3 討論

本實驗建立了穩(wěn)定、 可靠、 重復(fù)性好的西紅花HPLC 指紋圖譜， 選取指標性成分作為特征峰， 并通過計算其與參比峰之間的比例關(guān)系為藥材質(zhì)量控制提供依據(jù)， 比以某一種或幾種成分含有量作為鑒別標準全面得多。

指紋圖譜共有模式為根據(jù)不同檢測目的， 通過軟件擬合不同批次樣品得到的對照圖譜。 本實驗收集了不同年份和產(chǎn)地的西紅花， 用所建立的對照指紋圖譜進行質(zhì)量檢測， 適用于大部分樣品， 還可根據(jù)不同檢測目的生成特定年份或產(chǎn)地的指紋圖譜。

應(yīng)用LC-MS 法對西紅花中特征性成分的離子碎片信息進行采集分析， 結(jié)合文獻及數(shù)據(jù)分析， 指認了其指紋圖譜中10 種成分。 西紅花中主要成分的對照品較難獲得， 通過質(zhì)譜技術(shù)所得化合物的碎片離子峰推測共有峰成分， 明確各成分比例關(guān)系，比僅標定若干共有峰的指紋圖譜更能全面評價藥材質(zhì)量。 本實驗指認的10 種成分中西紅花苷-I 和西紅花苷-II 區(qū)分了其順式及反式結(jié)構(gòu)， 目前對西紅花苷的藥理研究主要集中在其反式結(jié)構(gòu)上［16-18］，而一般認為化合物反式結(jié)構(gòu)的活性較順式結(jié)構(gòu)強，因此可通過比較不同西紅花中順、 反式西紅花苷-I和西紅花苷-II 的含有量加以區(qū)別。 同時， 2 種成分也是梔子主要化合物， 部分西紅花摻偽就是添加兩者所致， 而應(yīng)用指紋圖譜對西紅花進行質(zhì)量評價時， 可通過分析不同成分間的比例關(guān)系來發(fā)現(xiàn)這種行為。

對成分的簡單指認并不是指紋圖譜建立的最終目的， 仍需進行相關(guān)藥理實驗， 明確具體藥效成分， 在化學(xué)成分與藥理活性之間建立更明確的關(guān)系， 通過指紋圖譜直觀了解某種藥物的品質(zhì)。