2 種輔助方法提取川芎揮發油成分GC-MS 分析

韋小翠， 楊書婷， 張 焱， 潘 旻， 潘曉慧， 程建明?

（1. 南京中醫藥大學藥學院， 江蘇 南京210023； 2. 江蘇省中藥功效物質重點實驗室， 江蘇 南京210023）

川芎為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort. 的干燥根莖［1］， 揮發油是其主要藥效成分之一， 具有鎮痛、 鎮靜、 改善血管、 保護神經細胞、解熱等作用［2］， 在臨床上具有很好的應用前景。目前， 川芎揮發油的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法、 溶劑萃取法［3］、 提取-共沸精餾耦合法［4］、 超臨界CO2萃 取法［5］、 超聲法［6］、 蒸餾-萃 取法［7］等， 另外酶解提取和鹽析輔助提取是近年來揮發油提取新工藝， 已有較多文獻報道［8-9］。 本實驗研究2 種新工藝對川芎揮發油提取率及化學成分的影響， 并與傳統水蒸氣蒸餾法進行比較， 以期為該成分提取工藝研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 7890A／5975C 氣質色譜-質譜聯用儀（美國安捷倫公司）； 揮發油提取器（天長市唐氏實驗儀器有限公司）； JP-500C 高速多功能粉碎機（永康市久品工貿有限公司）； ZNHW-Ⅱ智能恒溫電熱套（鞏義市予華儀器有限責任公司）； 電子天平（上海光正醫療儀器有限公司）。

1.2 試藥 川芎（安徽協和成藥業飲片有限公司， 批號15123008）。 水為蒸餾水； 氯化鈉（南京化學試劑股份有限公司， 批號170911101F）， 無水硫酸鈉、 檸檬酸鈉（西隴化工股份有限公司， 批號1410121、 1404032）， 檸檬酸（國藥集團化學試劑有限公司， 批號T20100420） 均為分析純； 正己烷（色譜純， 上海阿拉丁生化科技有限公司， 批號E1725082）； 纖維素酶（里氏木酶） （上海源葉生物科技有限公司， 生物試劑， 50 U／mg）。

2 方法與結果

2.1 揮發油提取

2.1.1 水蒸氣蒸餾法（T1） 稱取川芎粉末（過2 號篩） 200 g， 置3 000 mL 圓底燒瓶中， 加入1 200 mL 蒸餾水、 數粒玻璃珠， 充分混合后置50 ℃水浴浸泡2 h， 水蒸氣蒸餾提取6 h 后停止加熱， 分取油層， 無水硫酸鈉干燥靜置離心， 用移液槍轉移揮發油置棕色瓶中稱定質量， 密封， 保存于4 ℃冰箱中備用。

2.1.2 酶解輔助水蒸氣蒸餾法［10-11］（T2） 稱取川芎粉末（過2 號篩） 200 g， 置3 000 mL 圓底燒瓶中， 加入pH 4.8 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液1 200 mL、 1%原料質量的纖維素酶， 充分振搖混合， 置50 ℃水浴浸泡2 h， 間歇攪拌， 進行酶解預處理。 水蒸氣蒸餾提取6 h 后停止加熱， 收集油層，無水硫酸鈉干燥靜置離心， 用移液槍轉移揮發油置棕色瓶中稱定質量， 密封， 保存于4 ℃冰箱中備用。

2.1.3 鹽析輔助水蒸氣蒸餾法［12］（T3） 稱取川芎粉末（過2 號篩） 200 g， 置3 000 mL 圓底燒瓶中， 加入1 200 mL 蒸餾水、 5%氯化鈉溶液， 充分振搖混合， 置50 ℃水浴浸泡2 h， 間歇攪拌， 進行鹽析輔助處理。 水蒸氣蒸餾提取6 h 后停止加熱，收集油層， 無水硫酸鈉干燥靜置離心， 用移液槍轉移揮發油置棕色瓶中稱定質量， 密封， 保存于4 ℃冰箱中備用。

2.2 揮發油成分分析

2.2.1 色譜條件 HP-VOC 毛細管柱 （60 m×0.32 mm， 1.8 μm）； 載氣氦氣； 程序升溫， 初始90 ℃， 20 ℃／min 升 至170 ℃， 4 ℃／min 升 至230 ℃， 1.5 ℃／min升至260 ℃， 保持3 min； 進樣口溫度250 ℃； 分流比17 ∶1； 輔助線溫度230 ℃；進樣量1.0 μL； 體積流量1 mL／min。 離子源溫度230 ℃； 四極桿溫度150 ℃； 溶劑延遲5.6 min；EI 源電離方式； 質量掃描范圍m／z 35 ～500； 質譜檢索數據庫NIST11。

2.2.2 供試品溶液制備 精密吸取揮發油提取物50 μL， 加入1.0 mL 正己烷稀釋， 即得， 吸取1.0 μL注入氣相色譜儀中測定。

2.3 結果分析

2.3.1 提取率 按照各方法提取揮發油后計算提取率， 公式為提取率＝（揮發油質量／原料質量） ×100%， 結果見表1， 可知3 種提取方法的得率依次為T3＞T2＞T1， 即酶解、 鹽析輔助水蒸氣蒸餾法均能顯著提高得率， 分別為水蒸氣蒸餾法的1.28、1.6 倍， 以后者更高。

表1 3 種提取方法下川芎揮發油提取率Tab.1 Extraction rates of Chuanxiong Rhizoma volatile oil extracted by three extraction methods

2.3.2 化學成分 3 種方法所得樣品經GC-MS 分析后得總離子流圖， 見圖1 ～3， 經NIST 庫檢索及查閱相關文獻［13-16］， 鑒定出可能的化學成分，見表2。 由此可知， 水蒸氣蒸餾法所得揮發油中共鑒定出55 種化合物， 占總峰面積的90.61%， 其中酯類化合物8 種， 占59.9%； 烯類化合物26 種，占11.43%； 醇類化合物8 種， 占5.47%； 酮類化合物2 種， 占1.43%； 酚類 化合 物2 種， 占1.69%； 其他9 種， 占10.69%， 藁本內酯含有量最 高， 達 34.22%， 其 次 是 洋 川 芎 內 酯（14.30%）、 丁烯基酞內酯（7.33%）、 丁基苯酞（6.46%）。 酶解輔助水蒸氣蒸餾法所得揮發油中共鑒定出53 種化合物， 占總峰面積的90.13%， 其中酯類化合物8 種， 占56.24%； 烯類化合物25種， 占15.8%； 醇類化合物7 種， 占4.81%； 酮類化合物2 種， 占3.5%； 酚類化合物2 種， 占0.67%； 其他9 種， 占9.11%， 藁本內酯含有量最高， 達35.78%， 其次是洋川芎內酯 （8.59%）、丁烯基酞內酯 （7.17%）、 丁基苯酞 （5.21%）。鹽析輔助水蒸氣蒸餾法所得揮發油中共鑒定出52種化合物， 占總峰面積的92.06%， 其中酯類化合物8 種， 占68.1%； 烯類化合物24 種， 占8.92%；醇類化合物7 種， 占3.79%； 酮類化合物2 種， 占0.91%； 酚類化合物2 種， 占1.37%； 其他9 種，占8.97%， 藁本內酯含有量最高， 達38.17%， 其次是洋川芎 內 酯 （18.22%）、 丁 烯基酞內酯（7.20%）、 丁基苯酞（6.90%）。

圖1 水蒸氣蒸餾法提取川芎揮發油總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatogram of Chuanxiong Rhizoma volatile oil extracted by steam distillation method

圖2 酶解輔助水蒸氣蒸餾法提取川芎揮發油總離子流圖Fig.2 Total ion current chromatogram of Chuanxiong Rhizoma volatile oil extracted by enzymatic hydrolysisassisted steam distillation method

表2 為常規水蒸氣蒸餾法（T1）、 纖維素酶解輔助水蒸氣蒸餾法（T2）、 NaCl 鹽析輔助水蒸氣蒸餾法（T3） 樣品分析結果， 可知酯類含有量依次為T3＞T1＞T2， 烯類含有量依次為T2＞T1＞T3， 醇類含有量依次為T1 ＞T2 ＞T3， 酮類含有量依次為T2＞T1＞T3， 酚類含有量依次為T1＞T3＞T2。 相對于水蒸氣蒸餾法， NaCl 鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提高了酯類成分比例， 其余成分比例相對降低； 與水蒸氣蒸餾法相比， 纖維素酶輔助水蒸氣蒸餾法除烯類和酮類比例有提高外， 其余成分比例相對降低。

3 討論

圖3 鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提取川芎揮發油總離子流圖Fig.3 Total ion current chromatogram of Chuanxiong Rhizoma volatile oil extracted by salting out assisted steam distillation method

表2 川芎揮發油化學成分Tab.2 Chemical constituents of Chuanxiong Rhizoma volatile oil

續表2

3 種方法提取的川芎揮發油成分基本相同， 但相對含有量存在一定差異。 共鑒定出56 個峰， 其中反式-藁本內酯相對含有量最高， 其次為洋川芎內酯、 丁烯基酞內酯、 丁基苯酞、 桉葉烯、 間-甲酚酯、 苯戊酮、 4-萜烯醇、 1， 2-環壬二烯、 桉油烯醇。 有些成分在水蒸氣蒸餾法提取中可以檢測出， 但在酶解、 鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提取中未檢測出， 如芳樟醇、 β-法呢烯、 十七醇等， 可能與其含有量較低或纖維素酶、 氯化鈉的加入抑制了部分成分溶出有關。 另外， 酶解、 鹽析輔助水蒸氣蒸餾法所得川芎揮發油化學成分與水蒸氣蒸餾法所得基本相同， 表明纖維素酶與氯化鈉的加入并不會破壞揮發油原有成分。

在用鹽析輔助水蒸氣蒸餾法提取揮發油時， 曾在其他條件相同的情況下分別考察了0.5%、2.5%、 5%、 7.5% 氯化鈉溶液對提取率的影響，發現它隨著氯化鈉濃度的增加逐漸提高， 5%時最高， 而繼續增加氯化鈉濃度變化不大， 因此選擇5%氯化鈉溶液進行研究。

水蒸氣蒸餾法是一種傳統的揮發油提取方法，對設備要求不高， 生產成本低， 因此工業上應用廣泛， 但其得率較低［17］； 酶解法和鹽析輔助法是近年來揮發油提取新技術， 具有提取效率高、 條件溫和、 活性成分含有量高等優點。 纖維素酶能水解纖維素， 破壞細胞壁， 從而促進揮發油逸出， 而在水中加入一定濃度氯化鈉能產生鹽析作用， 降低揮發油在水中的溶解度， 促進溶在水中的部分成分被蒸出， 進而提高得油率。結果表明， 酶解、 鹽析輔助水蒸氣蒸餾法均可提高提取率， 而且不破壞其成分， 無需特殊設備和有機溶劑， 能充分利用藥材資源， 具備工業化生產的條件與潛力， 其中后者操作簡便， 提取率更高， 并且氯化鈉價格低廉， 更適合作為提取川芎揮發油的輔助方法。