人參提取物對Ⅰ型干擾素及下游基因表達的調節作用

邊 帥， 孫 雪， 韓小偉， 趙大慶， 王佳雯

（長春中醫藥大學， 吉林省人參科學研究院， 吉林 長春130117）

目前， 已知人體產生的干擾素共有13 種， 分為Ⅰ型、 Ⅱ型、 Ⅲ型三大家族， 其中Ⅰ型干擾素以干擾素-α、 干擾素-β 為主， 由先天性免疫細胞（單核細胞和淋巴細胞） 分泌， 是參與抗病毒免疫的重要效應分子； Ⅱ型干擾素為干擾素-γ， 主要由活化后的T 細胞分泌產生； Ⅲ型干擾素為幾種干擾素-λ， 其已知的分布與功能都比較有限［1］。 Toll樣受體及維甲酸誘導基因Ⅰ樣受體途徑是機體感染后產生Ⅰ型干擾素的兩大主要途徑， 可利用胞內信號分子傳遞來激活轉錄因子IRF3／7， 從而啟動Ⅰ型干擾素基因表達［2］。 另外， 干擾素可通過促進下游一些干擾素刺激基因表達來達到抑制病毒復制的能力， 這些基因所編碼的蛋白包括Mx1 蛋白、BST-2 蛋白、 APOBEC 家族蛋白、 TRIM 蛋白等［3］。

近年來， 對人參提取物及皂苷抗病毒的研究有了初步進展， 發現人參提取物及人參皂苷對多種病毒的感染及病毒感染后的細胞炎癥或凋亡有一定抑制作用， 其中人參皂苷Re、 Rf、 Rg2能抑制柯薩奇病毒CVB3、 人鼻病毒HRV3、 腸道病毒EV71 感染［4］； Rb1、 Rg1處理細胞后顯著降低貓杯狀病毒FCV 和人甲肝病毒HAV 的感染率［5-6］； Rg3 能通過刺激TRAF6／TAK1 降解和抑制JNK／AP-1 信號通路來影響人乙肝病毒HBV 復制［7］； Rb2、 Rg3能保護新生小鼠免受輪狀病毒的感染［8］。 同時， 人參提取物作用于細胞時， 可減少H9N2 型流感病毒感染所帶來的細胞凋亡和DNA 損傷［9］； 對細胞進行人參提取物的預處理可降低鼠諾如病毒MNV 和FCV的感染［10］； 紅參對HIV-1 患者生存期具有一定的延長作用［11］， 這可能是通過調控一種或多種宿主抗病毒蛋白來完成， 如廣譜抗病毒的APOBEC3G（A3G）、 BST-2 等因子， 從而限制了多種病毒的感染。

本實驗以人參提取物為對象， 通過考察其對THP-1 細胞的作用來檢測Ⅰ型干擾素表達和分泌變化， 同時測定下游抗病毒因子表達， 在分子水平上研究其抗病毒具體機制。

1 材料

1.1 細胞和試劑 人單核細胞THP-1 （編號TIB-202）、 HEK293T （編號CRL-11268） （ATCC 細胞庫）； DMEM 高糖培養基 （編號SH30022.01）、1640 培養基 （編號SH30809.01）、 雙抗 （編號SV30010） （美國Hyclone 公司）； 胎牛血清（美國Gibco 公司， 16000-044）； DMSO （北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司， 編號77H00150）； Trizol（ 美 國 Thermo Fisher Scientfic 公 司， 編 號15596026）； 轉染試劑X-tremeGENE siRNA （瑞士Roche 公司， 編號04476093001）； ELISA 試劑盒（美國Cloud-Clone Corp 公司， 編號SEA033Hu、SEA222Hu）； 反轉錄試劑盒（日本TaKaRa 公司，編號RR037 A）； siRNA （上海吉瑪制藥技術有限公司）； PCR 引物（長春華大中天生物技術有限公司）。

1.2 儀器 二氧化碳細胞培養箱（美國Thermo 公司）； 生物安全柜（蘇州凈化設備有限公司）； Infinite?200 Pro 多功能微孔板分析儀（瑞士Tecan公司）； Real-Time PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 人參提取物制備 干燥人參根（產地吉林撫松） 粉碎-煎煮-濃縮-噴霧干燥-粉碎-過篩。 然后，取100 mg 成品（約為10 g 生藥材） 溶于1 mL 無菌水中， 37 ℃下助溶， 測得人參總皂苷含有量≥10%。

2.2 干擾素分泌水平檢測 THP-1 細胞接種于24孔板 中， 加 入 人 參 提 取 物 （ 終 質 量 濃 度0.5 mg／mL）， 48 h 后收集細胞培養液， 離心去除細胞， 取上清液， 通過ELISA 法檢測干擾素-α、干擾素-β 分泌情況。 操作過程如下： （1） 各組分和樣品置于室溫下； （2） 稀釋對照品； （3） 將樣品和對照品分別加入孔板中， 37 ℃下孵育2 h；（4） 移除液體， 加入稀釋過的一抗， 37 ℃下孵育1 h； （5） 移除液體， 洗滌3 次； （6） 加入稀釋過的二抗， 37 ℃下孵育0.5 h； （7） 移除液體， 洗滌5 次； （8） 加入顯色液， 37 ℃下孵育10 ～20 min，避光； （9） 加入終止液， 450 nm 波長下檢測， 根據標準曲線計算干擾素-α、 干擾素-β 濃度。

2.3 基因表達檢測 THP-1 細胞接種于24 孔板中， 加入人參提取物， 24 h 后收集細胞， Trizol 法提取RNA 并檢測其濃度， 通過逆轉錄酶及Oligo（dT） 進行逆轉錄PCR， 獲得cDNA。 然后， 應用熒光標記試劑和特異性引物， 通過熒光定量PCR儀進行擴增， 收集數據， 分析相對mRNA 量。 引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.4 細胞培養和轉染 THP-1 細胞培養于含10%胎牛血清的1640 培養基中， 培養溫度37 ℃， CO2體積分數5%； HEK293T 培養于含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養基中， 培養溫度37 ℃， CO2體積分數5%。 然后， 使用X-tremeGENE siRNA 轉染試劑， 按照使用說明書進行細胞轉染。

2.5 統計學分析 通過SPSS 19.0 軟件進行處理，樣本率比較采用卡方檢驗， 樣本均數比較采用成組設計的方差分析。 以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 人參提取物對Ⅰ型干擾素的誘導作用 圖1顯示， 與空白組比較， 人參提取物組干擾素-α 分泌水平顯著提高（P＜0.01）， 達到（92±7） pg／mL左右， 但對干擾素-β 無明顯影響（P＞0.05）。

圖1 人參提取物對干擾素-α、 干擾素-β 分泌水平的影響Fig.1 Effects of Ginseng Radix et Rhizoma extract on interferon-α and interferon-β secretion levels

3.2 人參提取物對干擾素-α 的誘導途徑 圖2 顯示， 與空白組比較， 在THP-1、 293T 細胞中加入Ⅰ型干擾素誘導劑poly （I ∶C） 后， 培養上清中干擾素-α 分泌水平均顯著提高（P＜0.01）； 人參提取物在THP-1 細胞中能顯著誘導其表達（P ＜0.01）， 但在293T 細胞中不明顯（P＞0.05）。

3.3 干擾素-α 下游基因表達 圖3 顯示， 與空白組比較， 人參提取物組BST-2、 APOBEC3G 表達顯著提高（P＜0.01）。

3.4 沉默干擾素-α 對BST-2、 APOBEC3G 表達的影響 圖4 顯示， 轉染靶向干擾素-α 的siRNA 后干擾素-α 表達顯著下降（P＜0.01）； 加入人參提取物后， BST-2、 APOBEC3G 表達顯著提高（P ＜0.01）； 但沉默干擾素-α 后， 即使再加入人參提取物兩者表達也無明顯提高（P＞0.05）。

4 討論

干擾素作為一種廣譜抗病毒劑， 并不能直接殺傷或抑制病毒， 而是通過一系列細胞信號通路產生多種抗病毒蛋白， 從而抑制多種病毒復制， 同時它還可增強T 淋巴細胞、 自然殺傷細胞、 巨噬細胞活力， 起到免疫調節的作用， 并增強機體免疫力，目前正應用于病毒性肝炎、 手足口病、 HPV 感染等多種疾病的治療中［12-15］。 研究表明， 多種中藥提取物具有提高機體內源性干擾素表達的能力， 其中人參作為一種使用廣泛的中藥材， 被認為具有提高機體免疫力的作用［16-17］。 本實驗發現， 人參提取物具有較強的誘導THP-1 細胞產生干擾素-α 作用， 但對干擾素-β 無誘導效果。

圖2 人參提取物對THP-1、 293T 細胞中干擾素-α 分泌水平的影響Fig.2 Effects of Ginseng Radix et Rhizoma extract on interfeton-α secretion levels in THP-1 and 293T cells

干擾素-α 主要通過Toll 樣受體及維甲酸誘導基因Ⅰ樣受體途徑來進行表達和分泌， 但在293T細胞中僅存在后一種途徑誘導方式［18］， 故通過該細胞可判斷誘導方式是否與維甲酸誘導基因Ⅰ樣受體途徑相關。 本實驗發現， 人參提取物無法激活293T 細胞內源性干擾素-α 分泌， 表明人參皂苷對干擾素-α 的誘導是通過Toll 樣受體途徑所致。

圖3 人參提取物對BST-2、 APOBEC3G 表達的影響Fig.3 Effects of Ginseng Radix et Rhizoma extract on BST-2 and APOBEC3G expressions

圖4 沉默干擾素-α 對BST-2、 APOBEC3G 表達的影響Fig.4 Effects of silenced interferon-α on BST-2 and APOBEC3G expressions

BST-2、 APOBEC3G 是干擾素激活的2 種重要廣譜抗病毒因子［19-20］， 加入人參提取物后可提高兩者表達。 但對干擾素-α 實施基因沉默技術后兩者表達均受到抑制， 說明誘導得到的干擾素具備正常的激活抗病毒因子功能， 也提示人參提取物可能提高多種其他抗病毒因子表達， 并激活免疫細胞的活力，一定程度上揭示了人參提高免疫力的分子機制。