大孔吸附樹脂純化刺梨多酚工藝的優化

劉祖望， 許夢捷， 黃 真， 程汝濱， 鐘曉明

（浙江中醫藥大學， 浙江 杭州310053）

多酚是一類含有羥基和苯環的極性化合物， 包括類黃酮、 酚酸、 單寧（水解和縮合）、 二苯乙烯、 木質素等， 主要分布在植物的葉、 花、 果實中， 對人體健康和營養平衡具有重要作用［1］， 在抗炎、 抗腫瘤、 護肝、 抗氧化、 清除自由基、 抑菌等方面具有良好的作用， 顯示了廣泛的應用前景［2-4］。 此外， 該成分還能有效抑制活性氧及自由基所造成的機體損傷［5］， 吸收日光中大部分200 ～300 nm 強紫外線輻射， 起到“紫外線過濾器” 作用［6］。 因此， 在日本有人將植物多酚稱為繼第六營養素膳食纖維之后的“第七類營養素”［7］。

刺梨為薔薇科植物單瓣繅絲花Rosa roxburghii Tratt.、 繅 絲 花 Rosa roxburghii Tratt. f. normalis Rehd. et Wils. 的果實， 又名茨梨、 木梨子、 文先果， 為貴州省少數民族用藥［8］， 其果實營養豐富，具有預防癌癥、 抗衰老、 抗動脈粥樣硬化、 抗心血管疾病等作用［9-11］， 含有多酚、 黃酮、 多糖、 三萜等成分， 其中對黃酮、 多糖的研究相對較多［12-13］，而對多酚的研究尚處于起步階段， 研究表明該成分具有較強的清除自由基等藥理作用［14-15］。 為了更好地開發利用刺梨多酚， 本實驗考察4 種大孔吸附樹脂對該成分的吸附和解吸性能， 以期優化純化工藝， 為后續相關研究奠定基礎， 也有利于刺梨資源和相關產品的深入開發利用， 提高當地經濟水平。

1 材料

1.1 試藥 刺梨購自香如故食品銷售有限公司，經浙江中醫藥大學中藥資源研究所陳孔榮副教授鑒定為單瓣繅絲花Rosa roxburghii Tratt. 的干燥果實。乙醇 （國藥集團化學試劑有限公司， 批號20170317）； 無水碳酸鈉（寧波市化學試劑有限公司， 批號20070728）； 福林酚試劑（北京索萊寶科技有限公司， 批號818H017）； 沒食子酸對照品（北京普天同創生物科技有限公司， 批號17022801）。 ADS-17、 HPD-600、 AB-8、 NKA-9 型大孔吸附樹脂購自滄州寶恩吸附材料科技有限公司， 具體物理參數見表1。

表1 大孔吸附樹脂物理參數Tab.1 Physical parameters for macroporous adsorption resins

1.2 儀器 電子天平（常州市幸運電子設備有限公司）； UV-1800 型紫外可見分光光度計（日本島津公司）； 恒溫水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）；超聲波清洗機（寧波新藝超聲設備有限公司）； 層析柱（1.0 cm×15.0 cm）。

2 方法及結果

2.1 多酚提取 干燥果實粉碎， 過50 目篩， 稱取適量粉末， 加入100 倍量70%乙醇， 250 W、 30 ℃下超聲提取40 min。 過濾， 濃縮， 得粗多酚浸膏。

2.2 多酚含有量測定

2.2.1 供試品溶液制備 取適量粗多酚轉移至100 mL 量瓶中， 蒸餾水定容， 搖勻， 即得。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取沒食子酸對照品10.0 mg， 置于5 mL 棕色量瓶中， 蒸餾水定容，搖 勻， 得 2 mg／mL 母 液， 蒸 餾 水 稀 釋 至0.1 mg／mL， 即得。

2.2.3 檢測波長選擇 采用Folin-Ciocaltean 法測定多酚含有量［16］。 吸取對照品溶液120 μL， 置于錫箔紙包裹不透光的5 mL 離心管中， 加入蒸餾水至500 μL 后， 再加入0.5 mL 福林酚試劑， 混勻，避光反應2 min， 接著加入2 mL 10%Na2CO3溶液，最后加入1 mL 蒸餾水， 搖勻， 置于40 ℃恒溫水浴鍋中暗浴30 min， 在200 ～800 nm 波長處掃描。 最終確定， 檢測波長為760 nm。

2.2.4 線性關系考察 精密稱取對照品溶液30、40、 60、 80、 100、 120、 140、 160、 180 μL， 置于錫箔紙包裹不透光的5 mL 離心管中， 按“2.2.3”項下方法處理， 測定760 nm 波長處的吸光度。 以沒食子酸質量濃度為橫坐標（X）， 吸光度為縱坐標（A） 進行回歸， 得到回歸方程為A ＝151.71X＋0.009 6 （R2＝0.999 5）， 在0.4～21.0 μg／mL 范圍內線性關系良好。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液120 μL，按“2.2.3” 項下方法于760 nm 波長處測定吸光度， 連續6 次， 測得其RSD 為0.8%， 表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復性試驗 取同一份供試品溶液， 按“2.2.3” 項下方法于760 nm 波長處測定吸光度，連續6 次， 測得其RSD 為1.7%， 表明該方法重復性良好。

2.2.7 穩定性試驗 取供試品溶液， 在0、 2、 4、8、 16、 24 h 按“2.2.3” 項下方法于760 nm 波長處測定吸光度， 測得其RSD 為2.8%， 表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取質量濃度已知的供試品溶液60 μL， 加入60 μL 對照品溶液混合， 同法制備6 份， 按“2.2.3” 項下方法于760 nm 波長處測定吸光度， 測得其平均加樣回收率為97.6%，RSD 為2.0%。

2.3 樹脂性能評價

2.3.1 預處理 將干凈樹脂用2 倍量95%乙醇浸泡24 h 以除雜， 并使其充分溶脹， 然后用95%乙醇淋洗至淋出液無白色渾濁， 再用蒸餾水淋洗至無醇味， 保存于蒸餾水中備用。

2.3.2 靜態吸附量、 解吸率的計算 將樹脂濾干，精密稱取1.0 g 于250 mL 具塞錐形瓶中。 取粗多酚1 g， 溶于200 mL 蒸餾水中， 測得其多酚質量濃度（C0）， 取50 mL 加到含樹脂的錐形瓶中， 于30 ℃恒溫水浴鍋中水浴24 h， 定時搖晃， 每隔一段時間吸取上清液測定吸光度， 測得溶液中剩余多酚質量濃度（C1）， 根據式（1） 計算靜態吸附量［16］（Qs表示吸附量， V 表示粗提液體積， M 表示樹脂質量）。

然后， 將充分吸附24 h 的樹脂取出， 過濾，置于250 mL 具塞錐形瓶中， 加入70%乙醇50 mL，于30 ℃恒溫水浴鍋中水浴24 h， 定時搖晃， 每隔一段時間吸取上清液測定吸光度， 測得溶液中剩余多酚質量濃度（C2）， 根據式（2） 計算解吸率（D 表示解吸率， V′表示解吸液體積， Q′表示吸附多酚量g）。

由圖1 可知， 4 種大孔吸附樹脂均可在短時間吸附大量多酚， 并且在吸附時間8 h 時基本達到平衡， 其中AB-8 型吸附量最大（8.19 mg／g）， 其次是 HPD-600 型 （ 7.87 mg／g ）、 NKA-9 型（6.69 mg／g）， ADS-17 型最小（4.17 mg／g）； 4 種大孔吸附樹脂在解吸初期均具有較大的解吸速率，并且在2 h 時基本達到平衡。 其中AB-8 型解吸率最大（91.47%）， 其次是ADS-17 型（87.55%），NKA-9 型、 HPD-600 型較小（71.78%、 63.72%）。綜上所述， AB-8 型大孔吸附樹脂不僅能在短時間內吸附大量多酚， 而且解吸率高， 解吸速度快， 故選擇其作進一步研究。

接著， 稱取5 g 樹脂裝柱， 取0.8 mg／mL 多酚粗提液， 以2 mL／min 體積流量過樹脂柱， 分段收集流出液， 每10 mL 為1 份， 共收集30 份， 測定各份流出液中多酚質量濃度， 以其質量濃度為上樣液質量濃度的10% 作為泄露點， 100% 作為飽和點［17］。 再稱取5 g 樹脂充分吸附1 h， 70%乙醇以2 mL／min 體積流量解吸， 分段收集流出液， 每10 mL為1 份， 共收集20 份， 測定各份流出液中多酚質量濃度。

由表2 可知， 隨著上樣液體積流量增大， 流出液中多酚含有量符合“S” 型增長趨勢［18］， 流出

圖1 大孔吸附樹脂吸附、 解吸曲線Fig.1 Absorption and desorption curves for macroporous adsorption resins

60 mL 時， 流出液中多酚質量濃度為0.08 mg／mL，到達 泄 露 點； 200 mL 時， 其 質 量 濃 度 為0.79 mg／mL， 與原溶液基本一致， 到達飽和點，故確定上樣量為200 mL。 在解吸初始階段， 吸附在大孔樹脂上的多酚即大量吸出， 解吸液體積為20 mL 時， 流出液中多酚質量濃度達到2.85 mg／mL； 40 mL 時， 其質量濃度達到最大值5.87 mg／mL； 隨著體積進一步增加， 其質量濃度開始下降， 在160 mL 時僅為0.10 mg／mL， 可認為解吸基本完成， 故確定解吸液體積為160 mL。

表2 曲線泄露、 解吸液體積Tab.2 Leakage and desorption solution volumes of curves

2.4 吸附單因素試驗 固定相應因素不變， 考察上樣液體積流量（1、 2、 3、 4、 5 mL／min）、 質量濃度 （0.6、 0.7、 0.8、 0.9、 1.0 mg／mL）、 pH（4、 5、 6、 7、 8） 對吸附量的影響。

由圖2A 可知， 上樣液體積流量為1 mL／min時吸附量最大， 達到8.17 mg／g； 其體積流量逐漸增大時， 吸附量隨之減小， 在大于3 mL／min 時更顯著。 上樣液體積流量過大時， 多酚尚未被樹脂吸附即流出， 導致吸附量較小； 過小時， 會導致操作時間過長， 增加成本， 而且在3 mL／min 時吸附量仍在7 mg／g 以上， 故選擇其作為響應面水平。

由圖 2B 可知， 上樣液質量濃度低于0.8 mg／mL時， 吸附量隨著其增大而顯著提高； 大于0.8 mg／mL 時， 吸附量趨于平穩， 在1 mg／mL時達到最大值8.16 mg／g， 之后有下降趨勢。 上樣液質量濃度過低時， 溶液中多酚尚未與樹脂充分接觸即吸出， 從而造成漏液現象； 過高時， 溶液中雜質增多， 與多酚產生競爭關系， 導致吸附量較小，同時可能會生成沉淀， 故選擇0.8 mg／mL 作為響應面水平。

由圖2C 可知， 吸附量隨著pH 升高而增大，在6 時達到最大值8.17 mg／g， 之后隨著pH 進一步升高而呈現降低趨勢。 多酚以酚酸類為主， 故溶液具有一定酸性， 而pH 高低會引起多酚存在形式的變化， 即在酸性條件下有利于大孔吸附樹脂對該成分的吸附。 經測定， 上樣液pH 為5.9， 與最大吸附效果下pH 6 相近， 故選擇不作調節的上樣液作為響應面水平。

圖2 吸附單因素試驗結果Fig.2 Results of single factor tests for absorption

2.5 解吸單因素試驗 固定相應因素不變， 考察解吸 液 （ 乙 醇） 體 積 流 量 （ 1、 2、 3、 4、5 mL／min）、 體積分數（50%、 60%、 70%、 80%、90%）、 pH （4、 5、 6、 7、 8） 對解吸率的影響。

由圖3A 可知， 隨著解吸液體積流量增大， 解吸 率 逐 漸 降 低， 1 mL／min 時 為 92.14%， 而5 mL／min時僅為80.15%， 這可能是因為解吸液體積流量較大時， 它與大孔吸附樹脂的接觸時間較短， 導致多酚無法從大孔吸附樹脂中充分解吸出來， 最終造成解吸率降低， 但體積流量過低會造成時間、 成本大幅上升。 由于解吸液體積流量為3 mL／min時， 解吸率仍能達到85% 以上， 故選擇其作為響應面水平。

由圖3B 可知， 解吸液體積分數低于70% 時，解吸率隨著其增大而提高， 在70% 時達到最大值92.51%， 但之后隨著其體積分數進一步增大反而減小， 在90%時僅為79.14%， 故選擇70%作為響應面水平。

由圖3C 可知， 解吸液pH 小于6 時， 隨著其增大解吸率提高， 在6 時達到最大值93.12%； pH大于6 時， 解吸率隨著其增大反而降低， 這可能與多酚呈酸性有關， 故選擇6 作為響應面水平。

圖3 解吸單因素試驗結果Fig.3 Results of single factor tests for desorption

2.6 響應面法優化 依據中心組合試驗設計原理，通過Design-Expert 軟件， 選擇上樣液體積流量（A1）、 上樣液質量濃度（B1）、 上樣液pH （C1）作為影響因素， 吸附量作為評價指標； 選擇解吸液體積流量（A2）、 解吸液體積分數（B2）、 解吸液pH （C2） 作為影響因素， 解吸率作為評價指標。因素水平見表3。

表3 因素水平Tab.3 Factors and levels

在單因素試驗基礎上， 通過Design-Expert 軟件設計3 因素3 水平共17 個試驗點， 結果見表4， 得到吸附量（Y1） 回歸方程為Y1＝8.17-0.025A1-0.086B1-0.34C1-0.010A1B1＋0.13A1C1＋0.077B1C1-0.14-0.25-0.93， 解吸率（Y2） 回歸方程為Y2＝92.95-2.66A2-0.81B2＋1.10C2-1.51A2B2-1.19A2C2＋2.18B2C2-8.95-4.11-3.89， 方差分析見表5。 由表可知， 吸附模型顯著 （P ＜0.05）， 準 確 性 和 通 用 性 良 好 （R2＝0.937 9，＝0.858 0）， 各因素影響程度依次為上樣液pH（C1） ＞上樣液質量濃度（B1） ＞上樣液體積流量（A1）； 解吸模型顯著（P＜0.05）， 失擬度不顯著（P＞0.05）， 準確性和通用性良好（R2＝0.995 6，＝0.990 0）， 各因素影響程度依次為解吸液體積流量（A2） ＞解吸液pH （C2） ＞解吸液質量濃度 （B2）。

表4 試驗設計及結果Tab.4 Design and results of tests

響應面分析見圖4～5， 可知最優吸附條件為上樣 液 體 積 流 量 2.65 mL／min， 質 量 濃 度0.72 mg／mL， pH 5.59， 吸附量8.22 mg／g； 最優解吸條件為解吸液體積流量2.69 mL／min， 體積分數69.4%， pH 6.3， 解吸率93.26%。

2.7 驗證試驗 根據響應面法結果進行修正， 最終確定最優吸附條件為上樣液體積流量2.6 mL／min， 質量濃度0.7 mg／mL， pH 5.9； 最優解吸條件為解吸液體積流量2.7 mL／min， 體積分數69%， pH 6.3， 再進行3 批驗證試驗， 結果見表6， 可知模型擬合效果良好， 可信度高。 同時， 多酚回收率為20.37%， 其含有量由原來的7.40%提高到36.33%， 是純化前的4.9 倍。

表5 方差分析Tab.5 Analysis of variance

圖4 各因素響應面圖（吸附）Fig.4 Response surface plots for various factors （absorption）

表6 驗證試驗結果（n＝3）Tab.6 Results of verification tests （n＝3）

圖5 各因素響應面圖（解吸）Fig.5 Response surface plots for various factors（desorption）

3 討論

目前， 關于多酚純化工藝優化的研究主要是通過正交試驗結果， 但其難以篩選出因素最佳組合；響應面法采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關系， 通過分析回歸方程來尋找最優工藝參數， 從而解決多變量問題， 在提高藥用植物提取效率方面具有廣闊的應用前景［19-20］， 故本實驗采用該方法優化大孔吸附樹脂純化刺梨多酚工藝。 研究表明， 多酚藥理活性與其純度密切相關［21-22］， 由于刺梨多酚在刺梨果實中的含有量較低， 提取后粗多酚中雜質較多， 故為了加快該成分的開發利用進程， 針對其純化研究必不可少。 本實驗發現， 優化后該成分純度顯著提高， 進一步驗證了響應面法的優勢。

刺梨為云貴高原特有的野生植物， 其適應性強， 易栽種， 而且果實中含有大量黃酮、 維生素、多糖等成分， 具有廣闊的應用前景。 但目前對刺梨的開發利用僅限于其果脯、 果汁， 同時刺梨多酚作為其重要有效成分， 相關研究尚處于起步階段， 尚無其提取和純化工藝報道。 本實驗通過響應面法優化大孔吸附樹脂純化刺梨多酚工藝， 確定了最佳吸附、 解吸條件， 可有效提高提取物中該成分純度，為其后續藥理評價奠定基礎， 也給以其為原料的化妝品、 飲料等相關產品開發提供技術保障。