1,8-萘酰亞胺探針對乳品真蛋白中的檢測實驗設計與實踐

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(西安文理學院 化學工程學院 西安市環境與食品安全檢測工程研究中心，陜西 西安 710065)

西安文理學院應用化學專業的質量檢測方向，旨在培養可以從事食品、藥物、材料等方面進行分析檢測的綜合應用型人才。要求學生掌握基本的分析檢測方法，具備合格檢測人員應有的基本素養，并具有較強的分析問題和解決問題的能力。目前，本專業的實驗內容多為驗證性實驗，且實驗方法及檢測技術較為陳舊，難以調動學生學習的積極性，達不到全面培養學生綜合實驗素質的目標，因此對現有檢測方法進行更新，結合科研實驗成果，設計了以1,8-萘酰亞胺探針對乳品真蛋白乳品中酪蛋白進行定量分析的綜合實驗。

由于中國國家標準中乳品蛋白質檢測方法的缺陷，出現摻加尿素、銨肥、三聚氰胺等氮含量高的有機物來提高“蛋白質含量”的違法操作，嚴重制約了我國乳制品的質量提升，影響了消費者的身體健康，也為不法分子摻加劣質蛋白以提高蛋白質含量提供可乘之機[1-2]。因此，食品分析必須從真蛋白質測試入手，測定真蛋白質含量，才能夠有效避免假冒劣質蛋白質的濫竽充數。熒光探針法是蛋白質檢測及分析中常用的方法之一，具有快速、高效、儀器簡單、操作簡便等特點。但熒光探針在使用中普遍存在的一個問題是，當熒光官能團聚集時會發生熒光減弱或猝滅的現象[3]。近期本課題組的研究表明，1,8-萘酰亞胺熒光探針對酪蛋白的同步熒光呈現強烈的AIE特性，具有顯著的選擇性識別作用，經前期研究表明，探針的羧基官能團可能滲入酪蛋白內部，以疏水作用及氫鍵作用結合酪蛋白疏水腔中的色氨酸及酪氨酸殘基，而萘酰亞胺發光團及4-號位取代基團被阻擋在外部，聚集在膠團表面，呈現聚集誘導發光增強特性，導致酪蛋白同步熒光增強效應[4-5]。

綜上所述，本綜合實驗設計要求學生制備1,8-萘酰亞胺熒光探針，并研究其對酪蛋白膠團聚集誘導發光效應的作用機制，以建立具有普遍適用性、高效快速的酪蛋白熒光探針檢測分析法。實驗范圍較廣，設計方案新穎，與實際應用緊密相連，能夠極大調動學生學習實驗的積極性，教學效果良好。

1 實驗

1.1 實驗藥品與儀器

藥品：正丁醇(分析純，中國醫藥集團上海化學試劑公司)；乙二醇丁醚(分析純，中國醫藥集團上?；瘜W試劑公司)；十六烷基三甲基溴化銨(分析純，中國醫藥集團上?；瘜W試劑公司)；4-溴-1,8-萘酐(分析純，中國醫藥集團上?；瘜W試劑公司)；十八胺(分析純，上海阿拉丁試劑有限公司)。

儀器：恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司)；紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；顯微熔點測定儀(北京泰克儀器有限公司)；熒光分光光度計(日本島津制作所)；傅立葉變換紅外光譜儀(德國布魯克公司)。

1.2 實驗目的

(1)掌握1,8-萘酐亞胺探針的制備方法。

(2)了解紅外光譜(FTIR)、紫外吸收(UV-Vis)以及熒光光譜確定有機化合物結構的方法。

(3)掌握1,8-萘酐亞胺探針對酪蛋白聚集誘導發光特性的研究方法。

1.3 實驗步驟

(1)4-溴-N-十八烷基-1,8-萘酰亞胺。稱取2.0781g(0.0075 mol)4-溴-1,8-萘酐(A)和1.5291 g(0.0083 mol)十八胺(B)溶于100 mL無水乙醇中，磁力攪拌加熱至60 ℃回流，再降溫至50 ℃反應4 h，待反應液冷卻后抽濾，將濾餅真空干燥得到白色固體粉末2.6410 g，即得到中間產物4-溴-N-十八烷基-1,8-萘酰亞胺(G)。產率79.4%，熔點：165.3～166.3℃。

(2)1,8-萘酐亞胺探針的制備。稱取中間產物(G)1.056g(0.0020 mol)加入到50 mL燒瓶中，分別加入氫氧化鈉固體顆粒0.5 g，十六烷基三甲基溴化銨0.5 g，正丁醇25 mL，蒸餾水10 mL，磁力攪拌加熱至80 ℃，反應6 h，得到黃色渾濁液，待反應液冷卻后，抽濾、水洗、干燥得到亮黃色固體。將亮黃色固體溶解于適量的無水乙醇中，冷卻至2～5 ℃，靜置24 h后，加入適量的蒸餾水，待固體完全析出，抽濾，真空干燥，得到黃綠色固體粉末4-丁氧基-N-十八烷基-1,8-萘酰亞胺，硅膠柱層析，二氯甲烷為淋洗液。

(3)1,8-萘酐亞胺探針結構的測定。1,8-萘酐亞胺的FTIR分析在德國布魯克公司的衍射儀傅立葉變換紅外光譜儀上進行；1,8-萘酐亞胺的UV-Vis分析在北京普析通用儀器有限公司的紫外分光光度儀上進行；1,8-萘酐亞胺的熒光特性在日本島津制作所的熒光分光光度儀分析。

(4)1,8-萘酐亞胺探針對酪蛋白誘導發光性能的測定。通過探針Scatchard方程計算探針與酪蛋白的結合參數，從而研究其對酪蛋白誘導發光性能的影響。

2 實驗結果及分析

2.1 1,8-萘酐亞胺探針制備過程中需注意的問題

制備1,8-萘酐亞胺探針時，如何確定中間產物以及目標產物提純時重結晶等操作的溶劑的用量、溫度、時間等因素的影響。重結晶的結果直接影響到目標產物的性質，對產品的應用起到相當關鍵的作用，重結晶時需要考慮的因素較多，因此需要確定最優的重結晶的提純條件。要求學生提前查閱文獻資料，通過調變反應溫度及物料配比提高1,8-萘酐亞胺探針的產率較高，并確定1,8-萘酐亞胺探針的優化制備工藝。

2.2 1,8-萘酐亞胺探針的結構測定

1,8-萘酰亞胺分子結構上的萘環具有較大的共軛π鍵和平面結構，通過1,8-萘酐與十八胺的亞胺化反應，可以得到含有萘酰亞胺結構的熒光化合物。因此，在測定1,8-萘酰亞胺探針結構的時候，應當選用紅外光譜(FTIR)、紫外吸收(UV-Vis)以及熒光光譜共同對其結構進行確定。在此基礎上，要求學生掌握各種測試方法及結構分析的方法。

圖1 1,8-萘酰亞胺探針FTIR圖譜

圖2 1,8-萘酰亞胺探針UV-Vis 圖譜

1,8-萘酰亞胺探針UV-Vis 譜圖如圖2所示。學生由UV-Vis 圖譜可以看出化合物在波長為430.5 nm附近具有最大吸收峰，表明該種化合物的分子結構中存在較大的共軛關系和電子離域性。1,8-萘酰亞胺探針的紫外全波長掃描呈現較好的吸收，吸收曲線平滑，可能是該種化合物樣品的純度較高，且在乙醇溶液中的穩定性較好。

1,8-萘酰亞胺探針熒光光譜如圖3所示。學生由圖3-B中可以看出，1,8-萘酰亞胺探針的激發波長在λex=450 nm，通過確定激發波長，可以得到該化合物的發射波長范圍，且最大發射波長為545 nm，熒光相對強度較大，可能是引入的十八烷基和正丁基增大了萘酰亞胺分子結構的共軛性和平面結構。

圖3 1,8-萘酰亞胺探針的激發光譜(A,λex=450nm)和發射光譜(B,λem=545nm)

2.3 1,8-萘酐亞胺探針對酪蛋白聚集誘導發光效應的影響

酪蛋白是乳品真蛋白中最重要的蛋白質，大約占到總蛋白含量的80%，主要以膠團狀態存在于乳中，它是以含磷蛋白質為主體的幾種蛋白質的復合體，其中，酪蛋白含有大量疏水性的酪氨酸殘基。色氨酸和酪氨酸殘基位于位于酪蛋白疏水腔第一和第二子域之間，對于酪蛋白膠團的自組裝具有重要作用，同時也是酪蛋白在350 nm附近內源性熒光的主要體現基團設想探針的雙羧基作為前導嵌入式基團插入酪蛋白疏水腔中，與色氨酸和酪氨酸殘基以非共價鍵作用，如疏水、氫鍵作用等相結合，導致未結合的氨基酸殘基包埋在疏水腔中，使得酪蛋白膠團結構更加緊實；而1,8-萘酰亞胺熒光基元則吸附于膠團表面導致探針分子的聚集，引起聚集誘導發光效應。

探針與酪蛋白的結合參數由Scatchard方程計算：

log[(F0-F)/F]=logK+nlog[P]

(1)

K為結合常數，F0、F分別為探針加入前后酪蛋白的熒光強度，P為探針濃度，利用log[(F0-F)/F]對log[P]作圖可求得K和n，根據van't Hoff方程：

(2)

T分別為298、302、306和310K，以lnK對1/T作圖求得ΔH，ΔS，自由能變(ΔG)由下式計算：

ΔG=ΔH-TΔS

(3)

表1 探針與酪蛋白結合參數

探針與酪蛋白結合參數列于表1中；由表1可知，ΔH 為負值、ΔS 為正值，根據Ross判斷生物大分子與小分子作用力性質的規律表明，疏水作用及氫鍵作用為探針-酪蛋白復合物的主要結合作用力，其中疏水作用由于色氨酸殘基本身疏水性所致，而探針的雙羧基則是氫鍵作用的主要因素。

設想機理如圖4。

圖4 酪蛋白與探針聚集誘導發光機理圖

2.4 實驗拓展

學生可以進一步確定經濟合理、安全有效、產物產率較高的合成條件。已確定反應原料之一的4-溴-1,8-萘酐，另一種原料的確定需要綜合考慮各方面的因素，包括顏色、形狀、毒性、熔點、揮發性、穩定性等物理化學性質。

3 問題與討論

在該綜合實驗中需要學生思考及討論的問題如下：

(1)制備1,8-萘酐亞胺探針有哪些影響條件？

(2)紫外吸收光譜確定1,8-萘酐亞胺探針結構的原理是什么？

(3)1,8-萘酐亞胺探針對酪蛋白熒光發射性能有怎樣的影響？

4 教學特色

該實驗是為應用化學專業質檢方向大三學生開設的食品檢測綜合實驗，經過前2學年相關課程如有機化學、精細有機合成、精細化學品分析、食品質量檢測方法、天然化學產物等課程的學習，學生已經了解有機化合物的制備方法、紫外分光光度法及熒光分光光度法的基本原理。該綜合實驗要求學生獨立制備有機化合物，自主操作檢驗檢測儀器，并對所得數據進行分析，不但可以充分鍛煉了學生的實踐動手能力，也能夠強化學生的分析處理數據的能力。從實際的教學效果來看，該實驗極大調動了學生的學習積極性，能夠為學生后續的實際工作及進一步的學習深造打下堅實的基礎。

5 結束語

酪蛋白是乳品真蛋白中最重要的蛋白質，大約占到總蛋白含量的80%，主要以膠束狀態存在于乳中。由于國標中乳品蛋白質檢測方法的缺陷，出現摻加尿素、銨肥、三聚氰胺等氮含量高的有機物來提高“蛋白質含量”的違法操作，嚴重制約了我國乳制品的質量提升，影響了消費者的身體健康。因此，該綜合實驗結合當前大眾關注的食品安全檢測問題，將實驗室的科研成果轉化為教學和實驗教學內容，制備出新型的1,8-萘酰亞胺探針并實現其對酪蛋白的檢測，對質檢方向學生實驗操作及創新能力提出了新的要求，進一步促進了高效科教融合及教育轉型發展。